[發明專利]海水中病毒的濃縮方法及病毒濃縮回收率的測定方法

無效

• 申請號: 200910211151.0
• 申請日: 2009-11-06
• 公開（公告）號: CN102051347A
• 公開（公告）日: 2011-05-11
• 發明（設計）人: 樊景鳳;朱琳;吳利軍;明紅霞;李利利;陳佳瑩;付慧
• 申請（專利權）人: 國家海洋環境監測中心;南開大學
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所 11216
• 代理人: 劉激揚

1.一種海水中病毒的濃縮方法，該方法包括：

取水樣10L用雙層紗布過濾水樣至玻璃缸中；用1mol/L?HCl將10L海水樣品的pH調至3.5；加入終濃度為0.0005mol/L的AlCl₃，混勻；靜置30min后，用凈水器通過蠕動泵抽濾；海水全部濾過后，用pH為10.4的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液洗脫；洗脫液置于透析袋中用PEG-6000透析；在4℃條件下，將洗脫液濃縮至2mL左右，立即檢測或-20℃凍存。

2.根據權利要求1所述的方法進行的海水的預處理。

3.海水中病毒濃縮回收率的測定方法，該方法包括：

(1)制備陽性對照和陰性對照：用添加病毒減毒活疫苗的海水作為陽性對照，未添加病毒減毒活疫苗的滅菌海水作為陰性對照；

(2)用權利要求1所述的濃縮方法將添加病毒減毒活疫苗的海水和未添加病毒減毒活疫苗的海水進行濃縮，得到濃縮樣品；

(3)病毒PCR引物設計位于HAV基因組中編碼V1-V3衣殼蛋白的區域，目的片段長度為76bp；

(4)HAV標準曲線的建立：用EASY-Dillution將已知拷貝數的重組質粒作10²～10⁷6個梯度的稀釋；

20μL?RT-PCR反應體系為：10.0μL的SYBR?Premix?Ex?Taq(2×)、引物各0.4μL、0.4μL的ROX?Reference?Dye?II(50×)、質粒模板2.0μL和滅菌水6.8μL；

反應條件：95℃10s，95℃15s，60℃1min，40個循環，熔解曲線分析條件為95℃10s，60℃1min，95℃15s；

(5)根據標準曲線計算樣品中病毒的拷貝數，從而計算海水樣品中病毒的回收率。

4.根據權利要求3所述的病毒濃縮回收率的測定方法，其中病毒為甲型肝炎病毒。