[發明專利]分離抑制鏈孢霉生長的細菌的方法

無效

• 申請號: 200910201991.9
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN101717739A
• 公開（公告）日: 2010-06-02
• 發明（設計）人: 郭倩;林娓娓;李玉;王瑞娟
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院;上海科立特農科(集團)有限公司;上海國森生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/04;C12R1/40;C12R1/07
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術領域：

本發明涉及食用菌栽培領域，具體地說，涉及一種分離得到對食用菌栽培有危害的鏈孢霉起抑制作用的細菌的方法。

背景技術：

鏈孢霉是一種頑強、速生的氣生霉，主要危害各種食用菌菌種，也發生在栽培過程中，危害食用菌的菌絲體和子實體，極難防治，目前雖有化學藥劑防治，但尚未發現能有效抑制鏈孢霉生長的微生物。

鏈孢霉廣泛分布在自然界的土壤中、禾本科植物以及富含淀粉的食物上，能產生大量的分生孢子，靠氣流傳播。在培養室環境不衛生；或菌袋高壓滅菌不徹底；或棉塞受潮、過松；或菌袋破漏，是鏈孢霉初侵染的主要途徑。菌袋一旦受侵染后，所產生新的分生孢子，是再侵染的主要來源。在高溫高濕條件下，能在1-2天內傳遍整個培養室。

鏈孢霉是菌種生產期間危害最嚴重的一種病害。菌袋一經污染很難徹底清除，常引起整批菌種或菌袋報廢，經濟上損失很大。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題在于提供一種分離抑制鏈孢霉生長的細菌的方法，達到生物防治鏈孢霉的目的。

本發明的分離抑制鏈孢霉生長的細菌的方法，具體步驟為：

(1)采集樣品：在培養室里，根據房間大小，3-5個方位取點；采集的樣品于28℃培養箱培養3天；

(2)分離細菌：分離得到單株的純的細菌；

(3)篩選拮抗細菌：在接種有鏈孢霉的培養基平皿上，分別劃線待篩選菌；培養3天，若細菌和鏈孢霉之間存在拮抗線，則為能夠抑制鏈孢霉生長的細菌。

分離到的細菌可以通過16srDNA分子鑒定得出其種屬分類，具體方法為：提取抑制鏈孢霉的細菌基因組DNA后，PCR擴增，測序，比對，得出種屬分類結果。

本發明的優點：安全，無毒，方便快捷，只需要從采集的樣品中分離純化出細菌，進而篩選出能抑制鏈孢霉生長的細菌即可。

具體實施方式

本發明的具體實施方案是這樣實現的：

實施例1

(1)采集樣品

全過程采取無菌操作，穿白大褂，戴口罩，手套一次性手套(盡量減少自身攜帶菌)，在培養室里，在東、西、南、北、中五個方位取點，每個點三個重復。將倒有約15mlLB培養基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，調pH7.0-7.2，水1000ml，121℃滅菌20分鐘)平皿打開靜置于這些采樣點5分鐘，蓋上皿蓋，封口，于28℃培養箱培養3天。

(2)分離細菌

平皿中采集的細菌樣品分類編號，用接種環劃線于新的LB培養基平皿，于28℃培養箱培養3天，挑單菌落劃線于新的LB平皿。如此重復分離三次，得到純的細菌。

(3)篩選拮抗細菌

在LB培養基平皿中央接種鏈孢霉，于四周分別劃線待篩選菌，分別作距離中央約1cm、2cm、3cm、不劃線四個處理。培養3天后，觀察細菌和鏈孢霉之間是否產生拮抗線，若有，則為能夠抑制鏈孢霉生長的細菌。

最終發現3株細菌與鏈孢霉之間產生拮抗線。

16srDNA分子鑒定：提取基因組DNA后，PCR擴增，測序，比對，得出種屬分類結果：

菌種1的種屬分類為：

域：細菌

門：朊細菌

目：假單胞菌目

科：假單胞菌科

屬：假單胞菌屬

種：惡臭假單胞菌

命名：Pseudomonas?putida?lww-0709

菌種2的種屬分類為：

域：細菌

門：朊細菌

目：假單胞菌目

科：假單胞菌科

屬：假單胞菌屬

種：惡臭假單胞菌

命名：Pseudomonas?putida?lww-1021

菌種3的種屬分類為：

域：細菌

門：厚壁菌

綱：芽孢桿菌

目：芽孢桿菌

科：芽孢桿菌

屬：芽孢桿菌

種：短小芽孢桿菌

命名：Bacillus?pumilus?lww-0709