[發明專利]一種細胞周期調節相關基因的基因型檢測方法

有效

• 申請號: 200910201412.0
• 申請日: 2009-12-18
• 公開（公告）號: CN101712995A
• 公開（公告）日: 2010-05-26
• 發明（設計）人: 王校;傅詠南
• 申請（專利權）人: 上海中優醫藥高科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司 31001
• 代理人: 翁若瑩

技術領域

本發明涉及一種細胞周期調節相關基因的基因型檢測方法，用于檢測CCND1和STK15 基因的變異，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

大樣本量中國人群研究證實，細胞周期素CCND1和絲氨酸/蘇氨酸激酶STK15基因的 變異在中國人群眾普遍存在。以往的檢測方法在對CCND1和STK15基因進行檢測時出現的 假陽性現象無法很好的排查和解釋。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確率高的細胞周期調節相關基因的基因型檢測方法。

為了達到上述目的，本發明的技術方案是提供一種細胞周期調節相關基因的基因型檢 測方法，其特征在于，具體步驟為：

步驟1.檢測的樣品類型與采樣方法：

用采樣拭刮被測者口腔中左右兩腮各20次，以采集口腔粘膜上皮細胞樣本；

步驟2.基因組DNA的抽提方法：

采用硅膠吸附法抽提每一個被測者口腔上皮細胞樣本的基因組DNA，時間為2小時一 2.5小時，經電泳檢測后，肉眼可見清晰白色條帶即進入下一步檢測；

步驟3，熒光定量PCR反應：

將每一個被測者樣本分別放入2個反應孔，同時檢測2個位點，即細胞周期素(CCND1) rs9344和絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)s2273535，并增設2個不含DNA模版的NTC空 白對照孔；

在每一個反應孔中加入熒光定量PCR反應體系，其總體積為10μl，即2μl濃度為 20ng/μl的DNA模板、1μl10X熒光定量PCR反應緩沖液、0.1μl濃度為25mM的合成DNA 的四種脫氧核苷酸底物d?NTP、0.5μl濃度為25mM的氯化鎂溶液、0.02μl濃度為5units/μl 的Taq?DNA聚合酶、5.43μl去離子水、0.225μl濃度為20μM的正向引物、0.225μl濃度為 20μM的反向引物、0.25μl濃度為10μM的VIC熒光探針和0.25μl濃度為10μM的FAM熒光 探針，其中，2個位點的正向引物、反向引物、帶VIC熒光A型探針以及帶FAM熒光G型 探針如下：

細胞周期素(CCND1)SEQ?ID?NO1：Rs9344：

帶VIC熒光A型探針：ACCCaGTAAGTGA

帶FAM熒光G型探針：ACCCgGTAAGTGA

正向引物：TGGTGGCCGCAGTGCAAGGC

反向引物：TTGGCACCAGCCTCGGCATT

絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)SEQ?ID?NO2：Rs2273535：

帶VIC熒光A型探針：AAaTTGCTGAGT

帶FAM熒光T型探針：AAtTTGCTGAGT

正向引物：AGAATTTGAAGGACACAAGA

反向引物：TGCCAGAAAGTTTATTTTCT

將反應孔和空白對照孔在PCR擴增儀上進行反應，先進行預熱：50℃、2分鐘，95℃、 10分鐘，然后再進行60個循環的95℃、30秒，60℃、1分鐘，反應結束，取出后再放入熒 光定量PCR儀上讀取樣品熒光量，得到細胞周期素(CCND1)rs9344、絲氨酸/蘇氨酸激酶15 (STK15)s2273535兩張圖；

步驟4：SNP基因型分析：

將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣本熒光信號的2個圖和一個NTC空白對照進行比較， 每個位點存在三種不同的信號，純VIC熒光信號、VIC和FAM雜合熒光信號以及純FAM熒 光信號，分別代表該位點三種不同的基因型；

(1)、細胞周期素(CCND1)rs9344

在檢測結果圖中，坐標軸左下區域黑點為空白對照、坐標軸左上區域點為AA基因型、 坐標軸右上區域點為AG基因型、坐標軸右下區域點為GG基因型；

(2)、絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)rs2273535

在檢測結果圖中，坐標軸左下區域點為空白對照、坐標軸左上區域點為AA基因型、 坐標軸右上區域點為AT基因型、坐標軸右下區域點為TT基因型(該基因型在中國人群中 頻率很低)。