[發(fā)明專利]阿德福韋酯耐藥變異檢測試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910200496.6
• 申請日: 2009-12-23
• 公開（公告）號: CN102108391A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮哲民;鄒祖燁;賀憲民
• 申請（專利權(quán)）人: 上海主健生物工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體阿德福韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒，通過檢測阿德福韋酯用藥靶向位點(diǎn)基因多態(tài)性來評估個體阿德福韋酯物耐藥性。

背景技術(shù)

阿德福韋酯是阿德福韋的親脂性口服前體，其腸道吸收率和生物利用度都較高，口服后在非特異性酯酶水解作用下迅速轉(zhuǎn)化為阿德福韋。阿德福韋是一種無環(huán)單磷酸脫氧腺苷類似物，在體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為有活性的雙磷酸阿德福韋而起抗病毒作用。實(shí)驗研究和臨床試驗都證明阿德福韋酯可迅速降低乙肝病毒DNA的濃度，減輕肝臟組織的病變。

長期使用阿德福韋酯可誘導(dǎo)乙肝病毒變異，并產(chǎn)生耐藥性，使血清中已經(jīng)轉(zhuǎn)陰的乙肝病毒DNA重新出現(xiàn)，甚至伴有病情復(fù)發(fā)。

目前已知的阿德福韋酯耐藥主要原因為rtN236T位點(diǎn)變異。rtN236T變異則是由P基因第836位堿基A到C點(diǎn)突變引起，即發(fā)生了堿基間氫鍵的變化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種檢測個體阿德福韋酯耐藥變異遺傳的試劑盒。

該試劑盒包括：檢測阿德福韋酯耐藥變異位點(diǎn)P基因rtN236T位點(diǎn)多態(tài)性的特異性引物對及特異性熒光探針對，Taq酶，dNTP混合液，MgCl₂溶液，反應(yīng)緩沖液，去離子水。

本試劑盒中所述的特異性引物和熒光探針對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是能夠輕易完成設(shè)計的，特異性引物和熒光探針對可用常規(guī)的DNA合成技術(shù)進(jìn)行合成。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。

實(shí)施例??檢測試劑盒的使用

步驟1：DNA模板的抽取

用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。

步驟2：熒光定量PCR反應(yīng)

使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總體積10μl，包含濃度為20ng/μl的DNA模板2μl、1μl?10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.1μl?25mM?dNTP混合液、0.6μl?25mMMgCl₂溶液、0.025μl(5units/μl)Taq?DNA聚合酶、20μM的有義引物和反義引物各0.225μl、10μM的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25μl，去離子水5.325μl。

在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50℃、2分鐘，95℃、10分鐘，進(jìn)行60個循環(huán)的95℃、30秒，60℃、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。

步驟4：基因型分析

根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。

熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。