[發明專利]抑制犬p53基因表達的siRNA和p53基因沉默的犬細胞模型

無效

• 申請號: 200910199265.8
• 申請日: 2009-11-24
• 公開（公告）號: CN102071196A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 沈陽;馬志永;邱亞峰;史子學
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/63;C12N15/867;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種抑制犬p53基因表達的siRNA和一種p53基因沉默的犬細胞模型及它們的用途。

背景技術

腫瘤抑制蛋白p53是分子量為53KD的磷酸化蛋白，具有轉錄激活功能。p53蛋白在細胞周期調控、促進細胞凋亡、腫瘤發生和細胞分化等方面起到非常重要的作用。在正常細胞中p53蛋白的半衰期很短，含量極微。當細胞受到紫外線照射，基因毒試劑以及病毒感染等應激時，特別是細胞的DNA受到損傷時，p53蛋白的表達迅速增加，通過磷酸化、乙酰化等方式被激活。激活的p53蛋白進入細胞核，轉錄激活與調控細胞周期相關基因的表達，使DNA受到損傷的細胞周期停止在G1期，等待細胞修復受到損傷的DNA。當DNA的損傷嚴重時，細胞不能完成修復。為了防止不正常的細胞進行分裂，p53蛋白轉錄激活能促進細胞凋亡的基因，誘導不正常的細胞發生凋亡。當p53蛋白發生突變或腫瘤蛋白與p53蛋白結合影響了p53蛋白的正常功能時，細胞就可能發生癌變，使細胞永生化。在當今，癌癥成為人們健康越來越嚴重的威脅。如何治愈癌癥，或者延長病者的生存期，提高生存質量是醫者迫切解決的問題。

近年來研究發現，p53蛋白在細胞先天性免疫中也發揮重要的作用。水泡性口炎病毒在p53基因缺失細胞(p53-/-)里復制的病毒滴度是正常細胞的30倍，在感染的p53-/-小鼠血清里的滴度比正常小鼠的高100倍；而在p53基因多拷貝細胞(super?p53細胞)里，水泡性口炎病毒的滴度比正常細胞低10倍。在p53基因沉默細胞(p53knock?down細胞)中丙型肝炎病毒RNA的復制和病毒蛋白的表達顯著提高，而用IFN(Interferon，干擾素)處理p53knock?down細胞卻不能有效地抑制丙型肝炎病毒(HCV)RNA的復制。這些都表明p53分子在細胞先天性抗病毒免疫中也發揮重要作用。但是這些作用機制都未能明了，大量的免疫性疾病還沒有有效的治療方法。p53的作用機制亟待闡明，但是目前還沒有一個可以用于研究p53的細胞模型，限制了研究的開展和深入。

近年來研究發現，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞后，被裂解成siRNA(Small?interfering?RNA，小分子干擾RNA)，siRNA的雙鏈解開變成單鏈并和某些蛋白形成復合物，此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制被稱為RNA干擾(RNAi)。RNA干擾技術已經發展為高效、特異性阻斷細胞內目的基因表達的有效工具。是目前研究基因功能的一種重要的方法和手段。而且RNA干擾被廣泛應用于病毒感染、癌癥治療。dsRNA的導入細胞有多種方法。根據不同的細胞和研究對象可以選擇電穿孔法、微量注射法、浸泡法、磷酸鈣共沉淀法、質粒轉染法等方法。

但是由于RNAi在細胞內的半衰期很短，這些方法得到的RNAi效應不能持久。也有用腺病毒載體導入dsRNA片段，但也不能實現目的基因穩定地長期表達。慢病毒(Lentivirus)載體不但可以感染非分裂細胞，還具有容納外源性目的基因片段大、能夠整合到細胞基因組中、表達持久等優點。目前，已有利用RNA干擾技術抑制人p53基因表達的報道。但是，還沒有利用RNA干擾技術抑制犬p53基因表達的文獻資料。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對現在還未有p53基因沉默的犬細胞模型，對于與犬p53有關的腫瘤研究造成一定的影響，而且進一步限制了p53作用機制的深入研究，而提供一種抑制犬p53基因表達的siRNA和一種p53基因沉默的犬細胞模型及它們的用途，該siRNA能夠有效抑制犬p53基因表達，從而能夠應用于治療或預防犬p53基因相關的疾病，該p53基因沉默的犬細胞模型對于研究p53基因及其表達在腫瘤治療、細胞分化、細胞周期調節以及p53蛋白參與細胞先天性免疫的機制具有重要意義，從而為腫瘤、疾病的有效治療提供了可能性。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是：一種抑制犬p53基因表達的siRNA，其序列如序列表中SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二是：一種編碼如上所述的抑制犬p53基因表達的siRNA的DNA，其序列如序列表中SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4所示。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之三是：含有如上所述的抑制犬p53基因表達的siRNA的DNA的重組載體。