[發(fā)明專利]一種腈水解酶及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910196783.4
• 申請(qǐng)日: 2009-09-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102031247A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛建萍;唐璐敏;朱健;郝婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)藥研究所;薛建萍
• 主分類號(hào): C12N9/78
• 分類號(hào): C12N9/78;C12P7/42;C12R1/06
• 代理公司: 上海德昭知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 繆利明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種微生物來(lái)源的腈水解酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

腈水解酶是一種具有廣泛底物適應(yīng)性的生物催化劑，可以催化腈水解生成相應(yīng)的羥基酸。由于天然腈化物的廣泛存在，使很多微生物都或多或少具有降解腈化物的能力。目前已有多種微生物來(lái)源的腈水解酶被報(bào)道，其反應(yīng)底物多種多樣，具體如以下表1所示：

表1、用于制備腈水解酶的菌株及其對(duì)應(yīng)的水解底物

3-羥基丁酸俗稱β-羥基丁酸，英文名稱為3-hydroxybutyric?acid或DL-β-hydroxybutyricacid，其分子式為C₄H₈O₃，分子量104.10，CAS號(hào)為625-71-8，結(jié)構(gòu)式：

3-羥基丁酸有兩種構(gòu)型的對(duì)映體，分別為(R)-3-羥基丁酸[CAS：625-72-9]和(S)-3-羥基丁酸[CAS：6168-83-8]。

3-羥基丁酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途廣泛，例如(R)-3-羥基丁酸不僅可用于治療癌癥、糖代謝紊亂等疾病，還具有抑制酮體水平異常提高，減少自由基傷害，加強(qiáng)代謝效率等功效(WO2004108740)。同時(shí)，在可降解塑料合成中，3-羥基丁酸也有應(yīng)用價(jià)值，例如，以其為基礎(chǔ)可得到3-羥基脂肪酸，進(jìn)而制備具有生物可降解性和生物相容性的熱塑性材料聚羥基脂肪酸酯(PHB)。因此，制備3-羥基丁酸具有重要意義。

但現(xiàn)有工藝中，制備3-羥基丁酸主要通過(guò)化學(xué)方法，如β-丁內(nèi)酯的水解、Reformatsky反應(yīng)、還原法、丁烯酸水合制備、萘鋰催化劑制備以及水解法或氧化法等方法制備，但采用上述化學(xué)法具有以下不足：合成工藝復(fù)雜，反應(yīng)條件比較苛刻，對(duì)設(shè)備要求高，金屬催化劑價(jià)格昂貴，易造成污染，對(duì)環(huán)保不利等。

而生物法催化腈水解副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，但目前發(fā)現(xiàn)的腈水解酶中還沒(méi)有哪一種酶能夠水解3-羥基丁腈生產(chǎn)3-羥基丁酸。

發(fā)明內(nèi)容

本申請(qǐng)的發(fā)明人在長(zhǎng)期的研究中，找到了一種微生物來(lái)源的新的腈水解酶，其能夠水解3-羥基丁腈生產(chǎn)3-羥基丁酸。

因此，本發(fā)明的首要目的就在于，提供一種微生物來(lái)源的腈水解酶。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供所述腈水解酶的制備方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于，提供所述腈水解酶的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的腈水解酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：20所示。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，該腈水解酶的DNA序列如SEQ?ID?NO：19所示。

根據(jù)本發(fā)明，所述腈水解酶來(lái)源于Arthrobacter?nitroguajacolicus菌。

本發(fā)明提供的腈水解酶，通過(guò)發(fā)酵Arthrobacter?nitroguajacolicus菌而獲得。

本發(fā)明提供的腈水解酶可用于水解3-羥基丁腈生產(chǎn)3-羥基丁酸。

本發(fā)明提供了一種新的腈水解酶，該酶可用于水解3-羥基丁腈生產(chǎn)3-羥基丁酸，且反應(yīng)的水解副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，時(shí)空產(chǎn)率高。此外，由于3-羥基丁腈的水溶性好，因此水解反應(yīng)可以在純水相中進(jìn)行，有利于酶的穩(wěn)定，因而具有很高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

附圖說(shuō)明

圖1是細(xì)胞破碎離心后的上層粗酶液和放置8h后的上層粗酶液進(jìn)行電泳檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1為直接檢測(cè)的結(jié)果，泳道2為放置8h后的檢測(cè)結(jié)果。

圖2是經(jīng)苯基疏水柱純化后P3-P7號(hào)接收段溶液及粗酶液的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道1-5分別為P7-P3號(hào)接收段的檢測(cè)結(jié)果，泳道6為粗酶液的檢測(cè)結(jié)果。

圖3是經(jīng)丁基疏水柱純化后B2號(hào)接收段溶液的蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖4是回收酶切后的基因組和質(zhì)粒的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M是Marker，泳道1是基因組0.5-1kb部分的電泳結(jié)果，泳道2是基因組1-2kb部分的電泳結(jié)果，泳道3是基因組2-4kb部分的電泳結(jié)果，泳道4是pUC18的電泳結(jié)果。

圖5是轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒驗(yàn)證的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M是Marker，泳道1-12是不同轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的電泳結(jié)果。

圖6是片段NYNit9的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M是Marker，泳道1是NYNit9。

圖7是片段NYNit10的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分別是巢式PCR第一輪擴(kuò)增和第二輪擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果。

圖8是片段NYNit11的凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中，泳道M是Marker，泳道1和2分別是巢式PCR第一輪擴(kuò)增和第二輪擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果。