[發明專利]一種獲得內皮祖細胞的方法

有效

• 申請號: 200910196288.3
• 申請日: 2009-09-24
• 公開（公告）號: CN102031240A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發明（設計）人: 張文杰;龔軼一;李偉;陸陽;周廣東;崔磊;劉偉;曹誼林
• 申請（專利權）人: 上海國睿生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 張睿

技術領域

本發明涉及組織工程，尤其涉及獲得內皮祖細胞的方法。

背景技術

內皮祖細胞(endothelial?progenitor?cell，EPC)是成熟血管內皮細胞的前體細胞，自1997年Asahara等利用CD34等表面標志物經免疫磁珠法從人外周血中成功分離純化出EPC后，有關EPC的分離、純化、擴增及其功能和應用的研究越來越受到關注，特別是其在血管再生和心血管疾病中的作用已成為近來研究的熱點。

目前內皮祖細胞的來源主要為骨髓、外周血、臍血等。但是其數目較少，擴增較難使對其研究和應用受到限制。目前獲得內皮祖細胞的方式主要是骨髓、外周血、臍血經過密度梯度分離，接種于纖維粘連蛋白(fibronectin)鋪層的培養皿，再加入含一定濃度的生長因子的特殊培養液如EBM添加血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等培養，或者利用磁珠分選或流式細胞儀分選的方式，利用一些細胞表面粘附分子如CD34、KDR、CD133等進行分選后，獲得細胞再利用上述培養液進行培養擴增。近年有些報道利用上述細胞表面粘附分子培養的細胞向造血系分化，Marianna等研究發現由于血小板表面表達的粘附分子能夠被單核細胞吞噬假表達于某些不能向內皮細胞分化的單核細胞上，從而使利用這些粘附分子進行分選的細胞不能向內皮細胞分化。

目前純化和擴增EPC的方法操作過程復雜，細胞得率低，價格較為昂貴，極大地限制了其在研究和臨床應用方面的發展。

因此，本領域迫切需要提供一種能獲得大量純化的EPC的高效、簡便的方法。

發明內容

本發明旨在提供一種獲得內皮祖細胞的方法。

本發明提供了一種獲得內皮祖細胞的方法，所述方法包括步驟：將接種密度8×10⁴-6×10⁵/cm²的骨髓細胞孵育，得到的懸浮細胞為內皮祖細胞。

在另一優選例中，所述接種密度為1-6×10⁵/cm²。

在另一優選例中，所述的方法包括步驟：

(a)將骨髓細胞(原代；經胰酶消化)和細胞培養液混合，得到骨髓細胞懸浮液；和

(b)將骨髓細胞懸浮液以8×10⁴-6×10⁵/cm²的接種密度進行孵育，得到的懸浮細胞為內皮祖細胞。

在另一優選例中，所述的細胞培養液選自IMDM、或α-MEM。

在另一優選例中，所述的細胞培養液是低糖DMEM，以培養液總體積計，其中的胎牛血清含量為8-12v/v％。

在另一優選例中，所述的骨髓細胞懸浮液是1×10⁶-1×10⁷/ml。

在另一優選例中，所述接種密度為1-6×10⁵/cm²。

在另一優選例中，步驟(b)中孵育2-3周。

據此，本發明提供了一種能獲得大量純化的EPC的高效、簡便的方法。

附圖說明

圖1顯示了原代培養骨髓細胞表型(Day?6)；其中

A是相差光鏡；B是Dil-Ac-LDL染色；C是DAPI核襯染；D是熒光復合。

圖2顯示了不同接種密度的骨髓貼壁細胞培養情況；其中

A是6×10⁵/cm²接種培養第0天；B是6×10⁵/cm²接種培養第7天；C是5×10³/cm²接種培養第0天；D是5×10³/cm²接種培養第7天。

圖3顯示了不同接種密度的骨髓貼壁細胞培養7天的情況；其中