[發(fā)明專利]一種卡馬西平高效降解菌的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910195591.1
• 申請日: 2009-09-11
• 公開（公告）號: CN101691558A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 薛罡;楊林;劉亞男;龔清杰;高品;史錦;程起躍;周寧娟;王志樓
• 申請（專利權(quán)）人: 東華大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/40
• 代理公司: 上海泰能知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 31233
• 代理人: 黃志達;謝文凱

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物細菌的分離純化領(lǐng)域，特別是涉及一種卡馬西平高效降解菌的提取方法。

背景技術(shù)

隨著環(huán)境分析技術(shù)的提高和人們環(huán)境意識的增強，藥物及個人護理品(Phar?maceuticaland?Personal?Care?Products，簡稱PPCPs)作為一種新興污染物日益受到人們的關(guān)注。藥物和個人護理用品即使微量存在仍具有相當(dāng)程度的生物活性，給環(huán)境造成不可預(yù)測的影響，并可能通過飲用水和食物等途徑對人體健康產(chǎn)生潛在危害。

在常見的PPCPs化合物中，抗生素、消炎藥、抗癲癇藥物在各類環(huán)境介質(zhì)中的檢出頻率較高。其中抗癲癇藥卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)(分子結(jié)構(gòu)如圖1所示)由于藥效顯著，常作為治療癲癇病和神經(jīng)痛的首選藥物被大量使用，然而卡馬西平是含氮的芳香雜環(huán)化合物，目前傳統(tǒng)的污水處理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能夠有效去除，使其被頻繁檢出、且檢出濃度相對較高，具有一定的生態(tài)毒性，是目前最受關(guān)注的PPCPs類污染物之一。有研究者將其作為人為影響水環(huán)境的一種指示化合物，來評價PPCPs的污染狀況。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種卡馬西平高效降解菌的提取方法，該方法從城市污水處理廠二沉池的活性污泥中提取卡馬西平降解菌株，種源易得且分離純化方法簡便快捷，成本低，對環(huán)境友好；提取到的菌株對卡馬西平的降解率可達75％以上，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種卡馬西平高效降解菌的提取方法，包括：

(1)定向馴化培養(yǎng)

取活性污泥(城市污水處理廠二沉池)按5wt％的接入量接種于無機鹽培養(yǎng)基中，以梯度壓力式馴化法馴化2個月；

(2)菌株的富集分離和純化

將馴化2個月后的樣品靜置30min，取上層水樣1mL作梯度稀釋，然后每種稀釋濃度分別取1mL菌液于接種到固體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，確保長出純的單一菌株，再接種到斜面培養(yǎng)基，于4℃下保存，即可。

所述步驟(1)中的無機鹽培養(yǎng)基為K₂HPO₄4.35g/L，KH₂PO₄1.7g/L，NH₄Cl?2.1g/L，MgSO₄?0.2g/L，MnSO₄?0.05g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂00.01g/L，CaCl₂·2H₂00.03g/L，蒸餾水1000mL，pH＝6.8～7.0；

所述步驟(1)中的梯度壓力式馴化法為在無機鹽培養(yǎng)基中，分別依次加入卡馬西平使其濃度為3、5、10、15、20、22mg/L，改變濃度的間隔時間為10d，于30℃，振蕩速率160r/min條件下進行馴化培養(yǎng)；

所述步驟(2)中的梯度稀釋是指作10^-1～10^-10的梯度稀釋；

所述步驟(2)中的固體培養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入17g/L的瓊脂粉，加熱融化，冷卻后而形成的培養(yǎng)基，其中富集培養(yǎng)基為牛肉膏3.0g/L，蛋白陳10.0g/L，NaCl?5.0g/L，蒸餾水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培養(yǎng)基為將固體培養(yǎng)基加熱溶化，取干凈的試管，試管中倒入約5mL固體培養(yǎng)基，將試管口端放在玻璃棒上，使管內(nèi)培養(yǎng)基形成斜面而形成；

所述步驟(2)中的富集培養(yǎng)是指將菌液于接種到富集培養(yǎng)基后于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，挑取形態(tài)清晰的單一菌落，編號，在固體培養(yǎng)基上劃線，將培養(yǎng)皿倒置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，再觀察結(jié)果，在電子顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，反復(fù)2～4次，確保長出純的單一菌株；

所述的卡馬西平高效降解菌經(jīng)16S?rDNA序列測定，基因全序列如下：

TAAAGGGGGGGCAGGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTT

GATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAA

CGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT

CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGC

TCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTG