[發明專利]一種增強型畢赤酵母AOX1啟動子

有效

• 申請號: 200910195506.1
• 申請日: 2009-09-11
• 公開（公告）號: CN101654674A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 周祥山;張元興;宣姚吉
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12R1/84
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司
• 代理人: 王 潔

技術領域

本發明涉及基因表達調控技術領域，更具體地，涉及真核基因表達調控技術領域， 特別是指一種增強型畢赤酵母AOX1啟動子。

背景技術

巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)是近年來使用非常廣泛的一種酵母表達系統。 在畢赤酵母中存在兩個編碼醇氧化酶的基因：AOX1和AOX2。在甲醇誘導的條件下， AOX1蛋白能占細胞總蛋白的30％，AOX1的mRNA占總mRNA的5％。因此，目前在畢 赤酵母表達系統中，驅動外源基因表達的啟動子一般采用AOX1啟動子。為了提高外 源基因在畢赤酵母中的表達，一般的做法是通過G418、Zeocin等選擇壓力提高外源基 因在重組畢赤酵母染色體上整合的拷貝數。在相同拷貝數的情況下，極少有通過改變 AOX1啟動子的序列來提高外源基因表達的報道。2008年，Hartner等人通過構建啟動 子突變文庫，在AOX1基因啟動子上缺失-771至-712位堿基并形成兩拷貝-203至-190位 堿基序列時，報告基因GFP的表達量上升至160％(Nucleic?Acids?Res.36：e76)。

因此，本發明人嘗試構建增強型畢赤酵母AOX1啟動子，以期提高外源基因在畢 赤酵母中的表達，從而提高表達效率。

發明內容

本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種增強型畢赤酵母 AOX1啟動子，該增強型畢赤酵母AOX1啟動子能使其后插入的外源基因在畢赤酵母 中高效表達，從而提高了表達效率，適于表達載體的構建。

為了解決上述目的，在本發明的第一方面，提供了一種增強型畢赤酵母AOX1啟 動子，其特點是，所述增強型畢赤酵母AOX1啟動子包括由2-9個拷貝的SEQ?ID?NO：1 所示的核苷酸序列串聯的核苷酸片段和SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，所述核苷酸 片段連接在所述的SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列的5’端。

較佳地，所述的SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列的拷貝數為3、2或9。

在本發明的第二方面，提供了一種增強型畢赤酵母AOX1啟動子，其特點是，所 述增強型畢赤酵母AOX1啟動子與SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序列具有80％以上的同 源性。

較佳地，所述增強型畢赤酵母AOX1啟動子為所述的SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸 序列。

較佳地，所述增強型畢赤酵母AOX1啟動子為所述的SEQ?ID?NO：6所示的核苷酸 序列。

較佳地，所述增強型畢赤酵母AOX1啟動子為所述的SEQ?ID?NO：7所示的核苷酸 序列。

較佳地，所述增強型畢赤酵母AOX1啟動子為所述的SEQ?ID?NO：8所示的核苷酸 序列。

本發明的有益效果如下：

1)本發明的一種增強型畢赤酵母AOX1啟動子包括由2-9個拷貝的SEQ?ID?NO：1 所示的核苷酸序列串聯的核苷酸片段和SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列，所 述核苷酸片段連接在所述的SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列的5’端，應用該啟 動子驅動外源基因表達時，和天然AOX1啟動子相比，可使外源基因mRNA 轉錄平均增加25％-35％，使外源基因蛋白表達量平均增加45％-60％，可使外 源基因在畢赤酵母中表達更高效，適用于表達載體的構建；

2)本發明的另一種增強型畢赤酵母AOX1啟動子與SEQ?ID?NO：3所示的核苷酸序 列具有80％以上的同源性，采用該增強型畢赤酵母AOX1啟動子驅動外源基因 表達時，和天然AOX1啟動子相比，可使外源基因mRNA轉錄平均增加15％～ 20％，使外源基因蛋白表達量平均增加25％～37％，可使外源基因在畢赤酵母 中表達更高效，適用于表達載體的構建。

附圖說明

圖1是本發明的菌株R3表達GFP蛋白的柱形圖，以含有天然AOX1啟動子驅動的 GFP畢赤酵母菌株作為對照。

圖2是本發明的菌株R2表達GFP蛋白的柱形圖，以含有天然AOX1啟動子驅動的 GFP畢赤酵母菌株作為對照。

圖3是本發明的菌株R9表達GFP蛋白的柱形圖，以含有天然AOX1啟動子驅動的 GFP畢赤酵母菌株作為對照。

圖4是本發明的菌株M1表達GFP蛋白的柱形圖，以含有天然AOX1啟動子驅動的 GFP畢赤酵母菌株作為對照。