[發(fā)明專(zhuān)利]一種具有低細(xì)胞毒性、高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物基因載體及其制備方法和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910193876.1
• 申請(qǐng)日: 2009-11-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101791408A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王琴梅;何文;郭振寰;滕偉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院;中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): A61K47/36
• 分類(lèi)號(hào): A61K47/36;A61K47/32;A61K48/00
• 代理公司: 廣州知友專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 44104
• 代理人: 李海波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類(lèi)以海藻酸鈉為骨架、以聚乙烯亞胺為側(cè)鏈，可生物降解的陽(yáng)離子聚合物基因載體及其制備方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

基因治療是將具有治療意義的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至人體細(xì)胞，表達(dá)出所需要的多肽和蛋白質(zhì)，從而達(dá)到治病目的的一種新方法。如何利用載體將外源基因準(zhǔn)確有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞是基因治療成功的關(guān)鍵技術(shù)。基因載體包括病毒和非病毒載體。目前的臨床實(shí)驗(yàn)研究中80％采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等病毒類(lèi)載體。病毒載體的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率高，缺點(diǎn)是存在免疫原性、毒性、致癌性、宿主DNA插入整合等安全隱患。非病毒載體可克服前者在免疫原性及安全性等方面存在的問(wèn)題，而且具有物理化學(xué)性能可控、重復(fù)性好、易于制造、成本較低、裝載DNA的能力強(qiáng)，可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，因此正成為基因載體研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。但非病毒載體的最大問(wèn)題是轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低得多。?

非病毒載體包括陽(yáng)離子脂質(zhì)體和可降解陽(yáng)離子聚合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體外無(wú)血清基因轉(zhuǎn)染中有較高的效率，但有血清時(shí)則轉(zhuǎn)染效率極低。在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，它極易被血清迅速清除，并蓄積在肺組織，誘發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致高水平的毒性。而陽(yáng)離子聚合物載體具有優(yōu)異的DNA結(jié)合及保護(hù)能力，可方便地對(duì)其進(jìn)行靶向性及生物適用性改性，提高其抗血清能力及基因轉(zhuǎn)染效率、降低細(xì)胞毒性等，近年成為重要研究領(lǐng)域。?

為了提高陽(yáng)離子聚合物的基因轉(zhuǎn)染效率，研究者從基因治療過(guò)程中的兩個(gè)重要步驟，即基因傳輸和基因表達(dá)著手，設(shè)計(jì)了各種解決方案：如采用可降解陽(yáng)離子聚合物，使DNA/聚合物復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞后因聚合物的降解而使質(zhì)粒更容易和載體分離；在陽(yáng)離子聚合物中引入內(nèi)涵體破壞性基團(tuán)或成分，使復(fù)合物能從進(jìn)入細(xì)胞后形成的內(nèi)涵體中逸出；引入靶向基團(tuán)，使基因靶向傳輸?shù)教囟?xì)胞，進(jìn)而?增強(qiáng)復(fù)合物受體介導(dǎo)的內(nèi)吞；引入核定位信號(hào)因子，使復(fù)合物能在細(xì)胞液中接近細(xì)胞核并將DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核等來(lái)彌補(bǔ)轉(zhuǎn)染效率不足的缺點(diǎn)，這些方法目前都取得了一定的效果，但仍未達(dá)到臨床使用要求。?

目前用做基因載體的陽(yáng)離子聚合物包括聚賴(lài)氨酸、聚乙烯亞胺及其改性產(chǎn)物、聚酰胺基胺、聚氨基酯、聚脒、殼聚糖及其改性產(chǎn)物、帶有陽(yáng)離子側(cè)基的聚烯烴等。其中聚乙烯亞胺PEI具有優(yōu)良的DNA裝載能力，及可促進(jìn)DNA從內(nèi)涵體逃逸至細(xì)胞質(zhì)中的“質(zhì)子海綿”特性，是目前被研究得最多的具有較高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物基因載體，但它不可降解，且分子量越大，轉(zhuǎn)染效率越高，細(xì)胞毒性也越大。研究證明，當(dāng)PEI的分子量為25k時(shí)具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率、較高的細(xì)胞毒性；當(dāng)PEI的分子量＜2k時(shí)，基本無(wú)細(xì)胞毒性，且可通過(guò)代謝排出體外，但它的轉(zhuǎn)染效率也低。因此，研究者對(duì)PEI進(jìn)行了各種改性，以期進(jìn)一步提高其基因轉(zhuǎn)染效率和降低細(xì)胞毒性，適應(yīng)臨床的使用要求。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有低細(xì)胞毒性、高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物基因載體，該陽(yáng)離子聚合物基因載體具有生物相容性好、可控的降解性能、基因轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低、安全實(shí)用、成本低等優(yōu)點(diǎn)。?

本發(fā)明的目的還在于提供上述具有低細(xì)胞毒性、高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物的制備方法，該制備方法工藝簡(jiǎn)單、易于控制。?

本發(fā)明的目的還在于提供上述陽(yáng)離子聚合物在基因治療中作為基因載體的應(yīng)用。?

本發(fā)明提供的一種具有低細(xì)胞毒性、高轉(zhuǎn)染效率的陽(yáng)離子聚合物基因載體，其特征在于，該陽(yáng)離子聚合物基因載體以多醛基海藻酸鈉MASA為骨架、以聚乙烯亞胺PEI為側(cè)鏈構(gòu)成，其中聚乙烯亞胺PEI的分子量小于2K。?

本發(fā)明提供的陽(yáng)離子聚合物基因載體的其中一種制備方法，包括以下步驟：?

(1)取多醛基海藻酸鈉MASA溶于水中，得溶液1；?

(2)將聚乙烯亞胺PEI溶于水中，用酸液調(diào)節(jié)pH至6～11，得溶液2；?

(3)攪拌下將溶液1緩慢滴入溶液2中，滴完后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)；?

(4)將(3)中反應(yīng)液在蒸餾水中透析，濾去不溶物，凍干后得到聚乙烯亞胺-多醛基海藻酸鈉接枝共聚物MASA-PEI。?

本發(fā)明提供的陽(yáng)離子聚合物基因載體的另一種制備方法，包括以下步驟：?

(1)取多醛基海藻酸鈉MASA溶于水中，得溶液1；?

(2)將聚乙烯亞胺PEI溶于水中，用酸液調(diào)節(jié)pH至6～11，得溶液2；?

(3)攪拌下將溶液1緩慢滴入溶液2中，滴完后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)；?