[發明專利]在交變磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法

無效

• 申請號: 200910193432.8
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN101696439A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發明（設計）人: 李冰;寇靈梅;李琳;郭祀遠;陳玲;李曉璽
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P19/14
• 分類號: C12P19/14;C12N11/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;李衛東

1.一種在交變磁場三相流化床中提高固定化酶酶活和利用率的方法，其特征在于：包括如下步驟：將磁性固定化纖維素酶加入到磁場三相流化床酶解反應器中，施加磁場強度為0.5～2.5kA/m的交變磁場，再將流速1～10mL/min氣體鼓入磁場三相流化床酶解反應器，同時，將流速為1～10mL/min的反應溶液通入磁場三相流化床反應器，反應200～400min結束反應；使用后的磁性固定化纖維素酶回收后用去離子水沖洗至少3次，冷凍干燥，置于4℃保存；所述的反應溶液為含有可被所述磁性固定化纖維素酶降解的底物的緩沖溶液；所述底物的分子量為60000～100000；

所述的磁性固定化纖維素酶通過以下步驟制備得到：

(1)殼聚糖乙酸溶液的配制

用體積百分比為0.1～1％的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置30～50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用堿調pH為4.0～5.0，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)磁性殼聚糖微球的制備

在200～300mL殼聚糖乙酸溶液中加入3.5～5.0g?Fe₃O₄粉末，攪拌混合均勻，加入10～20mL司班-80、300～400mL石蠟，待分散均勻后，在40～60℃條件下加入10～20mL戊二醛，攪拌反應3～5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于60～65℃干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；

(3)磁性固定化纖維素酶的制備

將5.0～7.0g磁性殼聚糖微球加入250～300mL的0.2～0.5mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1～2小時，再加入100～200mL的2.0mg/mL纖維素酶液，于15～20℃以50～100rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6～16h后，在磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，去上清液，用0.2～0.5mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磁性固定化纖維素酶通過以下步驟制備得到：

(1)殼聚糖乙酸溶液的配制

用體積百分比為0.1～0.8％的乙酸溶液與殼聚糖溶液配置40～50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液，用堿調pH為4.0～5.0，得到殼聚糖乙酸溶液；

(2)磁性殼聚糖微球的制備

在200～250mL殼聚糖乙酸溶液中加入4.0～5.0g?Fe₃O₄粉末，攪拌混合均勻，加入12～20mL司班-80、320～400mL石蠟，待分散均勻后，在40～55℃條件下加入10～20mL戊二醛，攪拌反應3～5h，得到磁性微球，靜置冷卻至室溫，沖洗磁性微球，用磁場收集磁性微球，于60～65℃干燥篩分，得到磁性殼聚糖微球；

(3)磁性固定化纖維素酶的制備

將5.5～7.0g磁性殼聚糖微球加入260～300mL的0.2～0.4mol/L磷酸鈉緩沖液中溶脹1～1.5小時，再加入100～200mL的2.0mg/mL纖維素酶液，于15～18℃以50～90rpm的速度振蕩，讓磁性殼聚糖微球吸附纖維素酶，6～16h后，在磁場強度為50～100kA/m的磁場作用下，將磁性殼聚糖微球沉淀，去上清液，用0.2～0.4mol/L磷酸鈉緩沖液反復沖洗磁性殼聚糖微球，直至洗液中檢測不到蛋白為止，即得到磁性固定化纖維素酶。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的底物為殼聚糖。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的緩沖溶液為乙酸溶液。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反應溶液為pH值為4.0～5.0、濃度為30～50mg/mL的殼聚糖乙酸溶液；其中溶質是殼聚糖，溶劑是體積百分比為0.1～1％的乙酸溶液。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述磁性固定化纖維素酶的加入量為50～250g。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的堿為磷酸氫二鈉。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述沖洗磁性微球是用石油醚、無水乙醇依次沖洗磁性微球。