[發明專利]鉛離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條及制備方法和用途

有效

• 申請號: 200910192450.4
• 申請日: 2009-09-17
• 公開（公告）號: CN101655494A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 唐勇;向軍儉;翟一凡;鄧寧;王宏;楊紅宇
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577;G01N33/532;G01N33/52;C07K16/44;C07K14/77;C07K1/113
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司
• 代理人: 裘 暉;陳燕嫻

1.一種鉛離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟：?

（1）抗鉛離子單抗的制備和純化；所述抗鉛離子單抗的制備和純化按以下操作步驟：用雙功能二乙烯三胺五乙酸螯合劑將鉛離子偶聯到牛血清白蛋白上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選出穩定分泌抗鉛離子單克隆抗體的陽性細胞株并擴大培養，注射細胞進小鼠體內誘生腹水；取腹水加入2倍體積的醋酸鈉緩沖液，調節pH至4.5；于室溫攪拌下逐滴加入體積比為33?ul/ml的辛酸，4?℃下靜置、離心，得到上清液；調節上清液pH至7.4，4?℃冰浴下逐滴加入占上清液體積82?％的飽和硫酸銨溶液，靜置、離心，得沉淀；將沉淀溶于磷酸鹽緩沖溶液中，透析，4?℃下靜置過夜、離心，棄沉淀，得到抗鉛離子單抗；所述醋酸鈉緩沖液的摩爾體積比濃度為0.06?mol/L，pH值為5.0，所述磷酸鹽緩沖溶液的摩爾體積比濃度為0.01?mol/L，pH值為7.4；

（2）檢測抗原鉛-異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白的制備；所述鉛的檢測抗原鉛-異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白的制備按以下步驟：將異硫氰基二乙烯三胺五乙酸以質量體積比為20?mg/ml溶于二甲基亞砜中形成A液；將兔抗雞卵白蛋白以質量體積比為15.4?mg/?ml溶于300?μl三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽中，分別加入占三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽體積1.3?％的三乙胺和聚乙二醇600，形成B液；將A液逐滴加入B液中，振蕩24?h；用超濾管離心，得到異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白；取硝酸鉛21.1?mg溶于100?μl二甲基亞砜中形成C液；將C液逐滴加入異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白中，振蕩3?h；用超濾管離心，得到檢測抗原鉛-異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白；

（3）膠體金溶液的制備：取質量濃度為0.01?％的氯金酸水溶液100?mL，攪拌加熱至沸騰，一次性快速加入質量濃度為1?％的檸檬酸三鈉水溶液2.?2?mL，繼續攪拌加熱0.5～24小時，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻,?得到含有粒徑為20～40?nm的膠體金顆粒的膠體金溶液；

（4）抗鉛離子單抗標記的膠體金溶液的制備：取步驟（3）所得膠體金溶液100?mL，用摩爾濃度為0.25?mol/L?的碳酸鉀溶液將其pH值調至8.5；將步驟（1）所得抗鉛離子單抗1.6?mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.5～24小時；逐滴加入質量濃度為10?％的無菌牛血清白蛋白11?mL，攪拌0.5～24小時，4℃～30℃靜置過夜；將上述標記后的膠體金溶液于12000～14000?r/min離心40?min，棄去上清液，加入摩爾濃度為0.015?mol/L?的磷酸鹽緩沖液4?ml重懸，得到抗鉛離子單抗標記的膠體金溶液；

（5）噴金：把步驟（4）所得抗鉛離子單抗標記的膠體金溶液按2～10μl/cm的噴量噴在結合墊上，37?℃～45?℃抽風烘干，時間為5～24?h，得到噴金后的結合墊；

（6）硝酸纖維素膜上包被C，T線：在硝酸纖維素膜上包被C線和T線，其中C線為質控線，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，濃度為0.2～1.5?mg/ml；T線為檢測線，包被鉛的檢測抗原鉛-異硫氰基二乙烯三胺五乙酸-雞卵清白蛋白，濃度為0.1～0.9?mg/ml；37?℃～45?℃抽風烘干，時間為2～24?h；得到包被后的硝酸纖維素膜；

（7）鉛離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝：將聚氯乙烯底板、樣品墊、步驟（5）所得噴金后的結合墊、步驟（6）所得包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙按照以下所述方式組裝，切割成條，得到鉛離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條；

所述試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙以依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上制成的；所述包被后的硝酸纖維素膜上設置檢測線T線和質控線C線，其中檢測線T線靠近樣品墊一端；所述結合墊和樣品墊是將聚酯膜經過摩爾濃度為0.01～0.02?mol/L?的磷酸鹽緩沖液、質量體積比為3?g/100ml～6?g/100ml的非離子表面活性劑、體積比為1?ml/100ml～4??ml/100ml的吐溫20和質量體積比為5?g/100ml～20?g/100ml聚乙二醇6000組成的混合液中浸泡5～24?h，取出后于37～45?℃抽風烘干得到；所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0～7.5。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟（7）所述試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙粘貼在聚氯乙烯底板上，其中樣品墊和吸水紙位于兩端，包被后的硝酸纖維素膜的兩端分別位于結合墊和吸水紙的下面，結合墊的一端設置于樣品墊的下面，另一端設置于包被后的硝酸纖維素膜的上面。