[發明專利]一種慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法

無效

• 申請號: 200910192144.0
• 申請日: 2009-09-08
• 公開（公告）號: CN101654687A
• 公開（公告）日: 2010-02-24
• 發明（設計）人: 張永亮;習欠云;丁景華;吳珍芳;蔡偉光;張守全;江青艷
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A61D19/02
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明涉及制備轉基因豬的新技術。

背景技術

精子介導基因轉移方法是目前獲得轉基因豬簡單而高效的方法之一。該方法在小鼠、豬等動物上有過成功的報道，但隨后的研究中，由于轉基因的效率低而一度引起爭議，且不同的實驗室報道的結果差異很大，存在外源基因整合效率差的問題。

慢病毒被認為是制備轉基因豬的新型優良基因轉移載體。慢病毒即能感染分裂細胞又能感染非分裂細胞，可從生殖細胞到囊胚期各發育階段轉移外源基因。目前利用慢病毒載體感染動物胚胎、受精卵以及精原干細胞成功了生產轉基因鼠、羊、牛、豬、雞、魚等動物。

大量研究證實精子和慢病毒是基因轉移的理想載體，但是有關慢病毒和精子共孵育制備轉基因豬的研究國內外未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供了一種慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法。

一種慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法，包括如下步驟：慢病毒載體與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；然后經人工授精雌性動物，在子代動物篩選轉基因豬。

一種慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法，包括如下步驟：慢病毒載體與精子共孵育后，使精子吸附慢病毒載體；經體外受精，體外培養后胚胎移植，獲得轉基因豬。

在上述慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法中，所述慢病毒與精子共孵育的方法為：動物精液稀釋液洗去精清，取洗去精清的精子于人工授精瓶中，加入慢病毒液，蓋緊放于17℃保溫箱120min，其間每15min輕輕翻動精液瓶，防止精子沉淀聚集，送配種前10min檢驗活力，其活力達到0.5以上可進行人工受精。

在上述慢病毒與精子孵育制備轉基因豬的方法中，所述人工授精的方法為：選健康雌性動物，于發情當天肌注人類絨毛性腺激素，肌注后進行人工輸精。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明采用慢病毒與精子共孵育的技術，通過精子吸附慢病毒后再人工授精或體外受精，將慢病毒導入受精卵中，并將外源基因整合到胚胎基因組中，從而制備轉基因豬。從而克服了精子吸附裸DNA介導轉基因豬整合率非常低、遺傳不穩定等問題。該方法的突出特點是結合了慢病毒與精子載體的各自優點，操作簡便、成本較低。利用慢病毒載體與精子孵育，是一種低成本、操作簡便、轉基因效率較高的轉基因方法。

附圖說明

圖1為轉基因仔豬eGFP熒光觀察圖。

圖2為人工授精PCR檢測轉基因仔豬電泳圖。

1-8為仔豬樣品；除3號外，其它均能檢測到基因的存在。

圖3為人工授精PCR檢測陽性轉基因仔豬的Southern?blot結果圖。Control為已知陽性結果，陽為陽性仔豬雜交結果。

具體實施方式

實施例1慢病毒載體包裝

用293T包裝細胞制備慢病毒載體。在質粒DNA共轉染293T細胞前24h，消化傳代293T細胞，接種6×10⁶個細胞。質粒轉染前2～3h，更換細胞培養基，添加新鮮培養基。根據質粒DNA的濃度以及轉染細胞的數量計算出每種質粒的需要量(包裝質粒6125μg、轉移質粒6125μg和外膜質粒2150μg)。培養8h后，更換新鮮培養基。分別在轉染后的第1、第2和第3天采取完全更換新鮮培養液和不更換培養液兩種方式收集制備病毒載體，并測定載體滴度。收獲不同批次制備的病毒載體，采用大量制備試劑盒過濾后，高速梯度離心收集，于-80℃保存備用。

實施例2轉基因豬的制備

1、豬精子與慢病毒載體的共孵育

豬精液稀釋液(Swine?Fertilization?Medium，SFM)的配制：11.25g無水葡萄糖10g二水檸檬酸三鈉4.7g二水乙二胺四乙酸二鈉3.25g一水檸檬酸6.5g三羥甲基氨基甲烷加雙蒸水定容1升，最后加入6g牛血清白蛋白(BSA)，現配現用。

(1)確定與配公豬，檢驗精液品質，最近三次記錄合格目活力達到0.7以上。選擇試驗當天所采長白豬精液中精子活力最高的那份精液，收集精液中濃稠的部分5mL到15mL離心管中，加入當天配制好并預熱的SFM/BSA液5mL(注意兩者之間溫差一定要小于1℃)。室溫放置5min。

(2)將上述精液轉移至裝有40ml?SFM/BSA的50ml離心管中，25℃，800g離心10min小心吸去上清，加40ml?SFM/BSA(25℃)精子稀釋液于17℃800g離心10min小心吸去上清，加入3-4ml?SFM/BSA(17℃)輕輕吹打，使精子重懸。