[發明專利]腫瘤干細胞的分離方法

有效

• 申請號: 200910190868.1
• 申請日: 2009-09-15
• 公開（公告）號: CN102021138A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 余時滄;錢桂生;葉小群;王光輝;黃桂君
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06;C12N5/08;G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及細胞的分離方法，特別涉及腫瘤干細胞的分離方法。

背景技術

越來越多的證據表明，腫瘤細胞群體是一個異質性的細胞群體，其中只有腫瘤干細胞亞群才具備無限增殖、自我更新、多向分化和成瘤能力，是惡性腫瘤發生、進展和復發的根源，因此，深入研究腫瘤干細胞的特殊生物學特性具有十分重要的科學意義。

然而，由于數量稀少，從腫瘤細胞群體中分離腫瘤干細胞仍然較為困難。目前主要有三種方法用于腫瘤干細胞的分離：(1)基于CD133、CD44、CD34等表面標志物的熒光激活流式細胞分選和磁性細胞分選法。但由于絕大部分表面標志物均來自于正常干細胞，其作為腫瘤干細胞標志物的可靠性和特異性受到研究者的質疑。(2)基于腫瘤細胞對熒光染料Hoechst33342排出能力異質性的側群干細胞(SP細胞)分選法。目前研究發現，在某些腫瘤細胞群體中，SP表型并不適用于腫瘤干細胞的分離；而且，由于Hoechst33342自身具有一定的細胞毒性作用，也限制了該方法的應用。(3)基于腫瘤干細胞能夠在無血清干細胞培養基中獲得生長優勢的腫瘤干細胞球培養法。但部分祖細胞也能在無血清干細胞培養中獲得生長優勢。由于上述三種方法均有各自的局限性，因此，除繼續改進現有方法之外，尋找新的分離腫瘤干細胞的方法，也是今后努力的方向。

發明內容

有鑒于此，為克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種新的分離腫瘤干細胞的方法。

為達到此目的，本發明采用如下技術方案：

腫瘤干細胞的分離方法，根據細胞的線粒體膜電位分離腫瘤干細胞與分化腫瘤細胞，具有高線粒體膜電位的細胞亞群中富含腫瘤干細胞，具有低線粒體膜電位的細胞亞群中富含分化腫瘤細胞。

進一步，所述腫瘤干細胞的分離方法包括以下步驟：將腫瘤細胞制成單細胞懸液，加入能與線粒體特異結合的熒光染料共孵育，離心棄上清液，洗滌細胞，用流式細胞分選儀檢測細胞內熒光強度并進行細胞分選，收集熒光強度最高的1～5％細胞，即得具有高線粒體膜電位的細胞亞群，其富含腫瘤干細胞。

進一步，所述熒光染料為羅丹明123。

進一步，所述腫瘤細胞為肺癌細胞。

本發明的有益效果在于：本發明利用不同的方法比較了腫瘤干細胞與分化腫瘤細胞的線粒體膜電位，利用流式細胞儀分選獲得具有不同線粒體膜電位的腫瘤細胞亞群后，觀察了其克隆形成能力、自我更新能力和成瘤能力以及干細胞標志物的表達情況。結果證實，同分化腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞亞群具備更高的線粒體膜電位；而腫瘤細胞群體中具有高線粒體膜電位的細胞亞群具備腫瘤干細胞的特性。以上結果提示：腫瘤細胞群體中線粒體膜電位存在異質性，而這種異質性可以作為分離腫瘤干細胞的工具。據此，本發明提供了一種新的分離腫瘤干細胞的方法，具有潛在、良好的應用前景。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中：

圖1顯示了流式細胞分選的示意圖；

圖2顯示了肺癌A549細胞的三種形態克隆(光學顯微圖)，放大倍數為200倍。

圖3顯示了肺癌A549細胞不同形態克隆的線粒體膜電位(激光共聚焦顯微圖)，線粒體膜電位以羅丹明123(綠色熒光)的熒光強度表示，標尺為20μm。

圖4顯示了肺癌A549細胞不同形態克隆的線粒體膜電位(平均熒光強度統計圖)，兩組數據之間進行t檢驗：t＝-4.529，a：P＝0.000＜0.01。

圖5顯示了肺癌A549-SP細胞與非SP細胞的線粒體膜電位(激光共聚焦顯微圖)，箭頭所示處為SP細胞，其余為非SP細胞，細胞核以Hoechst33342(藍色熒光)標記，線粒體膜電位以羅丹明123(綠色熒光)的熒光強度表示，標尺為10μm。

圖6顯示了肺癌A549-SP細胞與非SP細胞的線粒體膜電位(平均熒光強度統計圖)，兩組數據之間進行t檢驗：t＝7.705，a：P＝0.000＜0.01。

圖7顯示了肺癌A549干細胞球的形態(光學顯微圖)，放大倍數為200倍。

圖8顯示了肺癌A549干細胞球細胞與貼壁未成球細胞的線粒體膜電位(流式細胞圖)，線粒體膜電位以羅丹明123的熒光強度表示。

圖9顯示了肺癌A549干細胞球細胞與貼壁未成球細胞的線粒體膜電位(平均熒光強度統計圖)，兩組數據之間進行t檢驗：t＝3.403；a：P＝0.014＜0.05。

圖10顯示了具有不同線粒體膜電位的肺癌A549細胞亞群形成的克隆(光學顯微圖)，放大倍數為200倍。