[發(fā)明專利]代謝調(diào)控嗜水氣單胞菌生產(chǎn)共聚物PHBHHx的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910188280.2
• 申請(qǐng)日: 2009-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN101696431A
• 公開（公告）日: 2010-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡風(fēng)慶;回晶;侯蕭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/62
• 分類號(hào): C12P7/62;C12R1/01
• 代理公司: 沈陽杰克知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物和生物工程領(lǐng)域，具體地涉及一種通過代謝調(diào)控 嗜水氣單胞菌生產(chǎn)含有不同比例3HHx的共聚物PHBHHx的方法。

背景技術(shù)

生物醫(yī)用材料(Biomedical?materials)也被稱為生物材料 (Biomaterials)，是一種能對(duì)機(jī)體的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行診斷、治療、 替代、修復(fù)、誘導(dǎo)、再生或增進(jìn)其功能的特殊的功能材料。當(dāng)今，生物 醫(yī)用材料已從20世紀(jì)的第一代和第二代生物醫(yī)用材料發(fā)展到基于細(xì)胞 和分子水平的第三代生物醫(yī)用材料。第三代生物醫(yī)用材料在生物體內(nèi)能 被降解，最終為機(jī)體所吸收，同時(shí)材料本身又具有生物活性，能夠參與 機(jī)體的生理活動(dòng)，在分子水平上激活基因，刺激相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)，從 而誘導(dǎo)組織和器官的形成，是細(xì)胞和基因的活性化材料(Cell?and Gene-activating?materials)。目前，第三代生物醫(yī)用材料已成為國(guó)際上材 料前沿領(lǐng)域一個(gè)十分活躍的研究方向。

聚羥基飽和脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate，PHA)因具有高分子 量、熱朔性、彈性及生物可降解性、生物相容性、憎水性、氣體阻隔性、 壓電性、非線性光學(xué)活性和由不同官能團(tuán)所帶來的獨(dú)特性質(zhì)，而被用作 藥物緩釋材料、組織工程材料(可植入人體的生物材料)，成為當(dāng)前倍 受關(guān)注的第三代生物醫(yī)用材料之一。PHA作為完全由生物體系合成的高 聚物，在許多方面優(yōu)于PLA。

PHA是細(xì)菌在生長(zhǎng)失衡情況下積累的一種細(xì)胞能源和碳源的儲(chǔ)存 物質(zhì)，到目前為止，至少有75個(gè)種屬，超過300種的生物體可以合成 150種不同組分的PHA，并且PHA粒子的結(jié)構(gòu)、物化特點(diǎn)、單體組成、 數(shù)量及大小等與產(chǎn)生PHA的生物體有關(guān)。

生物體所合成PHA的結(jié)構(gòu)和單體組成取決于微生物體內(nèi)合成PHA 的酶系統(tǒng)。在嗜水氣單胞菌(Aeromonas?hydrophila)CGMCC?NO.0911 中，PHA合酶基因與編碼PHA粒子結(jié)合蛋白(PhaP)和烯酰輔酶A水 合酶(PhaJ)的基因組成phaPCJ操縱子，PhaJ可催化2-enyol-CoA的R 專一的水合作用，產(chǎn)生的(R)-3-hydroxyacyl-CoA單體通過β-氧化途徑合 成新型PHA——聚羥基丁酸羥基己酸酯(PHBHHx)。一個(gè)比較有意義 的現(xiàn)象是，嗜水氣單胞菌僅可利用唯一碳源月桂酸經(jīng)β-氧化途徑合成 PHBHHx，不能利用葡萄糖來產(chǎn)生PHBHHx，甚至高濃度葡萄糖可明顯 抑制野生型嗜水氣單胞菌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

當(dāng)前，PHA的生產(chǎn)成本較高這一“瓶頸”制約著PHA不能廣泛的 應(yīng)用。而決定微生物合成PHA費(fèi)用居高不下的主要因素之一是底物， 即用于生產(chǎn)PHA的碳源，因此選擇較為便宜的碳源作為底物一直是從 事PHA研究的科學(xué)家們考慮的首要問題之一。嗜水氣單胞菌是一株非 常好的PHA產(chǎn)生菌，可以產(chǎn)生性能非常優(yōu)越的生物醫(yī)用材料PHBHHx， 但野生型嗜水氣單胞菌只能利用唯一的碳源月桂酸來產(chǎn)生PHBHHx，這 極大的限制和制約了其更為廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)野生型嗜水氣單胞菌不能利用葡萄糖合成PHA的問題， 通過代謝調(diào)控，實(shí)現(xiàn)野生型嗜水氣單胞菌利用葡萄糖合成PHBHHx。通 過調(diào)節(jié)不同碳源比例(葡萄糖/月桂酸)，通過代謝調(diào)控嗜水氣單胞菌建 立PHBHHx的合成平臺(tái)，根據(jù)不同領(lǐng)域需求，合成不同3HHx比例的 PHBHHx，滿足不同領(lǐng)域需求。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種代謝調(diào)控嗜水 氣單胞菌生產(chǎn)共聚物PHBHHx的方法，其步驟如下：

將嗜水氣單胞菌接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5～10％(v/v)， 添加碳源和酰基CoA，用稀H₂SO₄和氨水(或1N氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH?7.0～ 7.2，保持溫度30℃。通過攪拌控制溶氧，攪拌轉(zhuǎn)速控制在200～500r/min， 使溶氧保持10～20％，連續(xù)發(fā)酵48～72小時(shí)，根據(jù)需要合成含有不同 比例3HHx的共聚物PHBHHx；

其中，所述的碳源由葡萄糖和月桂酸組成。碳源中，葡萄糖和月桂 酸的配比是：葡萄糖用量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5～20％，月桂酸用量為 發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5～2％。

所述的嗜水氣單胞菌是嗜水氣單胞菌CGMCC?NO.0911。