[發(fā)明專利]去除疫苗制品中雜蛋白及宿主DNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910187321.6
• 申請(qǐng)日: 2009-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN102018958A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張譯;王凱;蘇文全;程曉耕;汪春義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧依生生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/205
• 分類號(hào): A61K39/205;A61P31/14
• 代理公司: 沈陽(yáng)科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 王勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及在疫苗制品中去除雜蛋白及宿主DNA的方法。

背景技術(shù)

目前狂犬病疫苗的提取普遍采用簡(jiǎn)單的分子篩凝膠層析提取，使用這種工藝提取得到的狂犬病疫苗，存在以下缺陷：

1、病毒疫苗在提取后仍含有過高的宿主蛋白，去除雜蛋白率不高，導(dǎo)致疫苗在臨床使用后有較大的副作用。

2、病毒疫苗提取后宿主DNA含量過高。

3、影響了病毒疫苗產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量，制約了疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)。

為此許多人在純化層析過程中，對(duì)層析柱連接方式進(jìn)行嘗試，對(duì)平衡鹽pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，改變層析用凝膠等方法，采用不同的純化方式，僅在結(jié)果上取得了輕微變化，沒能取得實(shí)質(zhì)上的變化。

狂犬病病毒疫苗是將狂犬病毒接種于適合的動(dòng)物細(xì)胞上，經(jīng)過動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)后產(chǎn)生抗體，釋放到培養(yǎng)液中，再經(jīng)濃縮純化后提取得到狂犬病病毒疫苗原液。在此過程中，會(huì)產(chǎn)生游離的宿主DNA及與抗原蛋白結(jié)合的宿主DNA，原液中還含有大量的宿主蛋白，濃縮純化工藝會(huì)將游離的DNA除去，但與抗原蛋白結(jié)合的DNA及宿主蛋白仍有很大一部分殘留在純化原液中，這部分DNA會(huì)隨著疫苗一起被注入到人體內(nèi)。由于異源物質(zhì)的注入，會(huì)在人體引起不良反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)對(duì)疫苗的處理要盡可能不損失抗原，即不影響疫苗制品的藥效，有效的去除雜蛋白及殘留宿主DNA的目標(biāo)，本發(fā)明的目的在于提供一種用超聲波振蕩處理疫苗中間產(chǎn)品-濃縮液和純化液，去除疫苗制品中雜蛋白及宿主DNA的方法，獲得雜蛋白及宿主DNA低含量的狂犬病病毒疫苗。

本發(fā)明有以下兩個(gè)技術(shù)方案：

方案一：以疫苗濃縮液為原料

1、使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理疫苗濃縮液；

2、經(jīng)過分子篩層析對(duì)上述濃縮液進(jìn)行第一次提純，得到本發(fā)明所稱的第一次純化液，觀察雜蛋白、宿主DNA的去除情況。

方案一的工藝流程是疫苗濃縮液→超聲處理→提純→本發(fā)明所稱的第一次純化液。

方案二：以常規(guī)的疫苗純化液為原料

1、使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲處理常規(guī)的疫苗純化液；

2、經(jīng)過分子篩層析對(duì)上述常規(guī)的疫苗純化液再次提純，得到本發(fā)明所稱的純化液，觀察雜蛋白、宿主DNA的去除情況。

方案二的工藝流程是常規(guī)的疫苗純化液→超聲處理→提純→本發(fā)明所稱的純化液。

利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)狂犬病疫苗進(jìn)行超聲處理，可以將雜蛋白、宿主DNA與狂犬病病毒抗原的結(jié)合打破、或者將宿主DNA粉碎，經(jīng)過分子篩層析純化后，分離得到純化的狂犬病疫苗，由于超聲波的波長(zhǎng)遠(yuǎn)大于狂犬病病毒抗原，所以超聲波不會(huì)對(duì)狂犬病病毒抗原產(chǎn)生強(qiáng)力的破壞，經(jīng)過合理的設(shè)置超聲程序，得到最佳的超聲波處理功率、工作時(shí)間、間隙時(shí)間、總工作時(shí)間等工作參數(shù)，可應(yīng)用于對(duì)狂犬病疫苗的處理。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，在不向疫苗制品中添加任何物理、化學(xué)、生物等物質(zhì)，保證疫苗抗原原始結(jié)構(gòu)的前提下，有效去除雜蛋白、宿主DNA的含量，突破疫苗制品的質(zhì)量瓶頸，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合實(shí)施例及圖譜詳盡說(shuō)明本發(fā)明。

附圖1：超聲后狂犬病疫苗濃縮、本發(fā)明所稱的第一次純化液及對(duì)照濃縮液分子篩層析純化圖譜，圖中曲線1是未超聲的狂犬病疫苗濃縮液分子篩層析純化圖譜，曲線2是超聲后的狂犬病疫苗濃縮液分子篩層析純化圖譜，曲線3是超聲后的本發(fā)明所稱的第一次純化液分子篩層析純化圖譜。

附圖2：超聲后狂犬病疫苗純化液及對(duì)照純化液分子篩層析純化圖譜，圖中曲線4是未超聲的狂犬病疫苗純化液分子篩層析純化圖譜，曲線5是超聲后的狂犬病疫苗純化液分子篩層析純化圖譜。

附圖3：狂犬病疫苗濃縮、本發(fā)明所稱的第一、二次純化液DNA檢測(cè)圖譜。

附圖4：狂犬病疫苗純化液及本發(fā)明所稱的純化液DNA檢測(cè)圖譜。

附圖5：DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜1，圖中Marker是DNA?marker?DL2000，1是純化液樣品(未超聲)，2是純化液樣品(超聲)，3是濃縮液樣品(未超聲)，4是濃縮液樣品(超聲)。

附圖6：DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜2，圖中Marker是DNA?marker?DL2000，5是純化液樣品(未超聲)，6是純化液樣品(超聲)，7是純化液樣品(超聲)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明的范圍。本實(shí)施例采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這些均是本技術(shù)領(lǐng)域人員所熟悉的，可以按照本實(shí)施例使用材料廠商所提供的說(shuō)明書即可進(jìn)行。

實(shí)施例一：針對(duì)方案一的實(shí)施例