[發(fā)明專利]宮頸異常細胞快速篩查方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910185772.6
• 申請日: 2009-12-02
• 公開（公告）號: CN101768626A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發(fā)明（設計）人: 沈玉先;方圣云;方輝;張協(xié)平;胡健力
• 申請（專利權）人: 合肥安旸生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/42
• 分類號: C12Q1/42;C12Q1/02;G01N33/50
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

研究背景

宮頸癌在女性惡性腫瘤占第二位，僅次于乳腺癌，全球大約每兩分鐘就有一位女性死于宮頸癌，全球每年估計有27萬女性死于宮頸癌，每年新發(fā)病例有50萬，其中大約有一半來自亞洲。

宮頸癌是早期發(fā)現(xiàn)可以成功治愈的癌癥之一。有大量證據(jù)表明早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌并進行治療，女性完全可以獲得康復。因此，疾病的早期發(fā)現(xiàn)至關重要。宮頸癌篩查是一項極具意義的公共衛(wèi)生措施。世界衛(wèi)生組織、所有發(fā)達國家及一些發(fā)展中國家的政府部門都在極力推進和鼓勵21-64歲的女性每年進行一次宮頸癌篩查，尤其對于性生活正常的女性，不管年齡大小，每年都需要進行此項檢查。

目前宮頸癌篩查方法的原理是基于對細胞形態(tài)學異常改變的觀察。遺憾的是，這項技術步驟過于復雜、耗時長，難以迎合進行大規(guī)模宮頸異常細胞篩查的要求。為了滿足這一需要，我們開發(fā)了這種宮頸異常細胞的快速篩查方法。本項發(fā)明通過增強在傳統(tǒng)涂片上異常宮頸細胞的可視性，來提高傳統(tǒng)涂片法的敏感性和特異性。

發(fā)明概述

酸性磷酸酶是在男性前列腺高表達的一種酶，酸性磷酸酶檢測已被當作一個生物標志物，來診斷前列腺癌及檢測腫瘤有否向身體其他組織擴散，同時也被用來檢測治療效果。為了檢測女性宮頸組織是否也有酸性磷酸酶表達，我們發(fā)現(xiàn)在宮頸異常細胞中酸性磷酸酶高表達，而在正常宮頸細胞中則沒有表達。這項發(fā)現(xiàn)提示酸性磷酸酶是宮頸異常細胞篩查的一個非常實用的生物標志物。利用酸性磷酸酶這個生物標志物，開發(fā)出新的檢測試劑盒用于宮頸異常細胞的篩查。這種新方法應用細胞染色技術，利用傳統(tǒng)宮頸涂片來檢測酸性磷酸酶的表達來甄別宮頸異常細胞，其原理是利用萘酚AS-BI鹽或萘酚AS-MX鹽作為酸性磷酸酶底物，利用快紅紫、固醬紫或品紅等重氮鹽作為偶聯(lián)物在異常細胞內形成紅色沉淀。這種方法選擇性標記宮頸異常細胞，而正常細胞則不會著色。因此，標記上紅色的異常宮頸細胞與傳統(tǒng)染色相比結果更鮮明突出，顯著增加了異常細胞的可視性。

這種結果可讀性的增強減少了傳統(tǒng)涂片染色或新發(fā)展的液基細胞學檢查中結果讀取過程中的模糊性。我們的臨床實驗結果顯示新的方法可以提高20％以上的靈敏度，降低假陰性率達60％以上。而且，新方法在可讀性方面的提高適用于自動化，因而顯著增加宮頸異常細胞篩查中的高敏感性和特異性的輸出。新的檢測方法更快捷、花費更小，同時采用了常規(guī)可靠的染色方法，這種檢測方法在可以進行傳統(tǒng)涂片檢查的任何實驗室都可以進行。新方法結果可讀性的增加同時也顯著減少了樣本檢測所需要的時間，傳統(tǒng)涂片染色的操作可以由實驗室技術員或醫(yī)務人員進行，但結果則需要專業(yè)的病理學家來解讀。

實驗方法

一、染色試劑盒成分：

(1)試劑A：固定液：10％福爾馬林

(2)試劑B：染色液：12.5克/升萘酚AS-BI磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺

(3)試劑C：鹽酸品紅：4％鹽酸品紅溶于2摩爾/升鹽酸

(4)試劑D：亞硝酸鈉：0.5摩爾/升

(5)試劑E：醋酸鈉溶液：2.5摩爾/升，pH?5.2

(6)試劑F：蘇木素復染液

(7)濾紙

二、染色步驟：

1.涂片在試劑A中固定1分鐘

2.用水充分洗凈

3.將試劑B，C，D，和E混勻后，用濾紙過濾到染色缸中

4.將涂片放入染色液中置于25-37℃染色20-30分鐘

5.用水充分洗凈

6.用試劑F染色1分鐘

7.封片或晾干，鏡檢

三、染色結果：

異常宮頸細胞胞質中有紅色沉淀，核呈藍色；正常細胞胞質無著色，核呈藍色。

說明書附圖

圖1臨床確診宮頸癌患者宮頸涂片染色示意圖，實體箭頭所示紅色為酸性磷酸酶著色部位，圖中A、B、C、D中實體箭頭所示細胞分別為來自不同受試者的酸性磷酸酶染色陽性細胞即宮頸異常細胞，B、C、D中空心箭頭所示細胞為著色陰性的正常宮頸細胞。

圖2E為健康對照宮頸涂片染色示意圖，無酸性磷酸酶陽性著色。F為宮頸癌細胞系Hela細胞染色示意圖，箭頭所示紅色為酸性磷酸酶著色部位，G為細胞放大2倍后效果。