[發(fā)明專利]建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡OAZ基因應(yīng)用模型的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910184790.2
• 申請(qǐng)日: 2009-08-21
• 公開（公告）號(hào): CN101629213A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馮學(xué)兵;孫凌云;李榮良;黃靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京中新達(dá)專利代理有限公司
• 代理人: 孫 鷗;吳 澄

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人類Olf-1/EBF相關(guān)鋅指蛋白(Olf-1/EBF?associated?zinc?finger?protein，OAZ)，特別涉及建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡OAZ基因應(yīng)用模型的方法。

背景技術(shù)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic?lupus?erythematosus，SLE)是典型的非器官特異性自身免疫病，以T、B細(xì)胞異常活化產(chǎn)生大量自身抗體為特征，被認(rèn)為是自身免疫病的原型。目前該病的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為遺傳因素在狼瘡發(fā)病過(guò)程中起重要作用。目前，治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡主要藥物有激素和免疫抑制劑，它們對(duì)人體免疫過(guò)程的多個(gè)環(huán)節(jié)均有明顯的非特異性免疫抑制作用，從而暫時(shí)抑制T、B細(xì)胞異常活化來(lái)達(dá)到治療的目的。但是，由于這些藥物治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡沒(méi)有特異性，所以只能緩解病情，不能達(dá)到根治的目的。并且它們會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，甚至可能成為患者死亡的直接原因之一，因而在臨床應(yīng)用中受到一定限制。

究其原因，主要是對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)理仍然不清楚，研究模式原始和簡(jiǎn)單，沒(méi)有一個(gè)從根本上對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制進(jìn)行分析、選擇和實(shí)驗(yàn)的生物模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種建立Olf-1/EBF相關(guān)鋅指蛋白基因的系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡OAZ基因應(yīng)用模型的方法，其主要技術(shù)步驟在于：

(1)采集并分離被測(cè)者外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入相應(yīng)的引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以分析OAZ基因的表達(dá)水平；

(2)用Spearman相關(guān)統(tǒng)計(jì)軟件分析OAZ基因的表達(dá)量與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)相關(guān)性；

(3)采集并分離患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，用OAZ小干擾RNA在體外對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行干擾，然后分離細(xì)胞和上清液，從細(xì)胞中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同分組OAZ信號(hào)通路相關(guān)基因OAZ表達(dá)水平的變化，ELISA法測(cè)定上清液中IFN-γ、IL4、IL10、IL12、IL21、CCL2、ANA濃度；

(4)將特異性選擇OAZ基因位點(diǎn)作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)；

(5)構(gòu)成系統(tǒng)性紅斑狼瘡OAZ基因應(yīng)用模型。

通過(guò)這個(gè)模型，研究人員可以發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者OAZ基因功能存在異常，即系統(tǒng)性紅斑狼瘡OAZ基因的表達(dá)量與SLE疾病易感性、活動(dòng)性成正相關(guān)。運(yùn)用RNAi干擾技術(shù)可有效降低狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中OAZ信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)，同時(shí)減低多種細(xì)胞因子及抗核抗體水平。因此，科研人員就可以借助該模型，根據(jù)不同患者的個(gè)體差異進(jìn)行特異性選擇，作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)，以選擇適當(dāng)?shù)乃幬飳?duì)該干預(yù)靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)治療研究，從而大大提高療效，避免盲目用藥給患者帶來(lái)的強(qiáng)烈的副作用。

本發(fā)明的其它優(yōu)越之處在下面將進(jìn)一步進(jìn)行闡述。

附圖說(shuō)明

圖1——本發(fā)明實(shí)施例1基因cDNA引物序列示意圖。

圖2——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者與正常人OAZ基因mRNA表達(dá)示意圖。

圖3——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者與正常人OAZ基因mRNA表達(dá)圖。

圖4——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者外周血OAZ基因表達(dá)與SLEDAI相關(guān)性示意圖。

圖5——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者外周血OAZ基因表達(dá)與與補(bǔ)體C3相關(guān)性示意圖。

圖6——本發(fā)明實(shí)施例10AZ基因表達(dá)與SLEDAI、腎臟損傷指數(shù)與補(bǔ)體C3相關(guān)性圖。

圖7——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者外周血抗ds-DNA抗體陽(yáng)性組與陰性組OAZ基因mRNA表達(dá)示意圖。

圖8——本發(fā)明實(shí)施例1SLE患者外周血ENA抗體陽(yáng)性組與陰性組OAZ基因mRNA表達(dá)示意圖。

圖9——本發(fā)明實(shí)施例1外周血抗體陽(yáng)性組與陰性組OAZ基因mRNA表達(dá)圖。

圖10——本發(fā)明實(shí)施例2基因cDNA?SiRNA和引物序列示意圖。

圖11——本發(fā)明實(shí)施例2RNAi后OAZ基因mRNA表達(dá)示意圖。

圖12——本發(fā)明實(shí)施例2RNAi后上清液細(xì)胞因子與ANA表達(dá)(X±S)示意圖。

圖13——本發(fā)明實(shí)施例2干擾后OAZ基因mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞因子水平相關(guān)性示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。