[發明專利]建立哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法

無效

• 申請號: 200910184012.3
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號: CN101633906A
• 公開（公告）日: 2010-01-27
• 發明（設計）人: 周林福;殷凱生;顧曉燕;張明順;季曉輝
• 申請（專利權）人: 周林福
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08;C12Q1/02
• 代理公司: 南京中新達專利代理有限公司
• 代理人: 孫 鷗;朱 杰

技術領域

本發明涉及一種醫學模型，特別涉及一種建立哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法。

背景技術

哮喘是CD4⁺T細胞介導的氣道過敏性疾病，其中嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)浸潤為顯著的病理學特征，II型輔助性T細胞(Th2)免疫亢進則是最重要的免疫學異常。樹突狀細胞(dendritic?cell，DC)是免疫應答的啟動者和維持者，在哮喘Th2免疫漂移過程中發揮關鍵作用。

單核細胞是巨噬細胞和DC共同的前體細胞，可在多種外源性細胞因子誘導下定向分化為DC。在粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)/白細胞介素4(IL-4)經典體系中，單核細胞約需要5天才能分化為未成熟DC，繼予成熟誘導劑脂多糖(LPS)或腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激2天后分化成熟。

在本發明之前，細胞因子環境雖賦予單核細胞定向分化的能力，但往往同時也改變了DC的功能及其遷移潛力，而且與體內實際的細胞因子濃度相去甚遠。因此，缺少一個實驗平臺的模型，無法進行真正模擬單核細胞在哮喘患者體內的分化成熟和遷移功能的實驗。

發明內容

本發明的目的就在于克服上述缺陷，設計、研制一種可供實驗用的建立哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法。

本發明的技術方案是：

建立哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法，其主要技術步驟在于：

(1)采用離心法，從哮喘患者外周血獲取血清；

(2)采用免疫磁珠法，從正常人外周血獲取單核細胞；

(3)采用胰酶消化法，從正常產婦臍帶獲取人臍靜脈內皮細胞；

(4)明膠預處理24孔細胞培養板，將傳代的內皮細胞懸液加入培養板并長至單層；

(5)哮喘患者血清重懸單核細胞，并加至內皮細胞單層上；

(6)2小時后，充分洗滌內皮細胞單層；

(7)36小時-48小時后，洗滌內皮細胞單層，回收懸浮細胞；

(8)得到哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型。

本發明的優點和效果在于內皮穿越模型是迄今唯一客觀模擬單核細胞在體內遷移分化為樹突狀細胞的非細胞因子依賴的體外模型，而且哮喘血清是患者真實的內環境。因此，本發明的目的就在于克服上述經典體系的缺陷，以最佳模擬樹突狀細胞遷移分化的內皮穿越模型為切入點，利用哮喘患者血清客觀模擬機體血清內環境，建立一種新穎的哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法。

本發明的優點和效果還在于建立了哮喘患者血清樹突狀細胞內皮穿越模型。通過該模型業已研究發現，哮喘患者血清可以引起樹突狀細胞核因子κB(NF-κB)過度激活、促進樹突狀細胞分化成熟。通過該模型，今后不僅可以深入研究哮喘血清促進樹突狀細胞異常分化的作用及機制，詮釋哮喘的免疫學發病機制，并且可以研究或篩選靶向樹突狀細胞的新型哮喘治療藥物，作為制備和驗證抗哮喘藥物作用機制的實驗平臺。

本發明的其他優點和效果將在下面繼續說明。

附圖說明

圖1——哮喘血清樹突狀細胞內皮細胞穿越模型的構建與鑒定示意圖。

圖2——哮喘血清內環境下單核細胞內皮逆穿越前后的表型和形態學改變示意圖。

具體實施方式

建立哮喘血清樹突狀細胞內皮穿越模型的方法如下：

(1)采用免疫磁珠法從人外周血獲取單核細胞；

(2)獲取正常產婦的新鮮臍帶(產房取出4小時內)，胰酶消化法(0.25％胰酶)獲取正常產婦臍帶靜脈來源的人臍靜脈內皮細胞，最佳消化時間為20分鐘，原代培養細胞70％融合時傳代；

(3)培養的內皮細胞長成單層后，相差顯微鏡下觀察內皮細胞呈鋪路石樣外觀，熒光顯微鏡下內皮細胞胞漿人VIII因子染色陽性；

(4)0.1％明膠預處理24孔細胞培養板，將傳代(第二代)的內皮細胞懸液加入培養板并長至單層，然后加入哮喘患者血清與正常人外周血來源的單核細胞，硝酸銀染色動態觀察單核細胞穿越內皮細胞單層；

(5)2小時后，充分洗滌內皮細胞單層(旨在去除內皮細胞上方未發生正向穿越的單核細胞)；

(6)36小時-48小時后，洗滌內皮細胞單層，回收懸浮細胞(即已經發生正向穿越和逆向穿越，回到內皮細胞上方的單核細胞來源的樹突狀細胞)，吉姆薩(Giemsa)染色、掃描電鏡(SEM)和流式細胞術(FCM)鑒定樹突狀細胞。