[發明專利]一種木醋桿菌熒光染色的方法

無效

• 申請號: 200910179340.4
• 申請日: 2009-09-22
• 公開（公告）號: CN101691599A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 曹獻英;杜晶晶;林強;張莉娜;馮玉紅;龐素娟;魯戰平
• 申請（專利權）人: 海南大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N1/30;G01N21/64;C12R1/02
• 代理公司: 海口翔翔專利事務有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

技術領域

本發明涉及一種熒光染色的方法，具體是采用染料對木醋桿菌進 行染色，在激發波長下激發，使木醋桿菌發射熒光，利用分子熒光光 譜儀和熒光顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡進行檢測、觀察木醋桿菌 生物學特性及細菌纖維素生物合成過程的木醋桿菌熒光染色的方法。

背景技術

細菌纖維素(Bacterial?cellulose，簡稱BC；或稱微生物纖維 素，microbial?cellulose)是由部分細菌產生的一類高分子化合物， 為了與植物來源的纖維素相區別，將其稱之為“細菌纖維素”，作為 一種新型多功能生物材料，細菌纖維素在醫藥、造紙、生物醫學、食 品中具有廣泛應用前景。研究表明，細菌纖維素是由葡萄糖分子以β -1，4糖苷鍵聚合成分子鏈，分子鏈間以氫鍵形成網狀結構，其生物 合成可分為聚合、分泌、組裝、結晶四大過程。

產生細菌纖維素的微生物中目前研究較為廣泛的是醋酸菌屬中 的木醋桿菌(Ace?tobac?ter?xylinum)，其合成的細菌纖維素在純度、 抗拉強度、楊氏模量等理化性能方面均優于植物纖維素，具有較高生 物適應性，并且在自然界中可直接降解。隨著醋酸菌的生長，由葡萄 糖分子聚合而成的纖維素分子鏈組裝成寬度為1.5nm左右的亞小纖 維，亞小纖維從細菌細胞壁表面間隔大約10nm的微孔分泌到培養基 中并組裝形成寬度為3～6nm的微纖維，然后微纖維進而組裝成寬度 約40～60mm的纖維絲帶，纖維絲帶扭曲相互纏繞進而產生晶體。若在 木醋桿菌培養體系中添加單糖或多糖，這些添加糖可能參與到細菌纖 維素的生物合成過程中，但對于添加糖怎樣參與細菌纖維素的生物合 成過程以及其是否進入菌體內部，目前還沒有相應的觀察、檢測方法， 經檢索也沒有相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種木醋桿菌熒光染色的方法，其采用熒光 染料對木醋桿菌細胞壁進行熒光標記，便于觀察和跟蹤在木醋桿菌培 養體系中添加糖的糖代謝過程，為進一步深入研究木醋桿菌的生物學 特性及細菌纖維素生物合成過程提供一種簡便可行的方法。

本發明所采用的技術方案：

一種木醋桿菌熒光染色的方法，是將木醋桿菌懸液離心，收集菌 體沉淀并分散于磷酸鹽緩沖生理鹽水體系中；將菌體懸液與1～ 10mg/mL的熒光染料水溶液在室溫下反應5～15分鐘，然后用在激發光 進行激發。

當對木醋桿菌進行熒光染色和激發光激發后，利用熒光顯微鏡及 激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察到菌體發射的熒光，并且用分子熒光 光譜儀檢測熒光強度，有利于觀察和跟蹤在木醋桿菌培養體系中添加 糖的糖代謝過程，有利于深入研究木醋桿菌的生物學特性及細菌纖維 素生物合成過程。

所述磷酸鹽緩沖生理鹽水體系的pH值為6.0～8.0。

所述熒光染料是沉香硫化氫(coriphosphine?O)。

所述激發光波長為450nm～500nm。

本發明簡單易行，無污染，原料價格低廉、易得，在不破壞生理 狀態的情況下利用熒光染料對木醋桿菌活體進行熒光染色，有利于對 木醋桿菌進行跟蹤檢測，有利于觀察和跟蹤木醋桿菌培養體系的代謝 過程，為進一步深入研究木醋桿菌的生物學特性及細菌纖維素生物合 成過程提供一種簡便可行的方法。

附圖說明

圖1是熒光顯微鏡下觀察染色后的木醋桿菌效果圖。

圖2是激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察染色后的木醋桿菌效果圖。

圖3是木醋桿菌染色后用分子熒光光譜儀檢測圖。

具體實施方式

下面結合具體實例和附圖對本發明方法作進一步說明；

實施例一

將3ml木醋桿菌懸液離心，收集菌體沉淀并分散于3ml，pH為 6.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中；再離心洗滌2次后將菌 體分散于3ml，pH6.0的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)體系中，使菌體 懸液與3μL、1mg/mL的沉香硫化氫水溶液混合，室溫下反應8分鐘； 用波長為460nm的激發光進行激發，即可用分子熒光光譜儀檢測染色 菌體發出的熒光強度(圖3系列1)；用熒光顯微鏡及激光掃描共聚 焦顯微鏡下觀察菌體發射的熒光。

實施例二