[發明專利]用質譜法高靈敏度定量肽

無效

• 申請號: 200910174762.2
• 申請日: 2003-10-02
• 公開（公告）號: CN101782581A
• 公開（公告）日: 2010-07-21
• 發明（設計）人: 諾曼·利·安德森
• 申請（專利權）人: 諾曼·利·安德森
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/567;G01N33/577;G01N27/62
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 唐偉杰

本申請是申請日為2003年10月2日，發明名稱為“用質譜法高靈敏度定量肽”以及申請號為200380103688.6的分案申請。

發明技術領域及背景

本發明涉及用于對如人血漿等的復雜樣品中的蛋白進行評價的定量分析。本發明可用于分析來自單一個體來源的樣品，也可用于評價群體中特定蛋白質的水平，并可用于分析來自目標人群的集合樣品。

需要對各種復雜蛋白質樣品中(例如人血漿中)的蛋白質進行定量分析。通常，這些分析以免疫試驗的方式進行，利用了相對于靶蛋白的特定抗體作為特異性試劑和檢測試劑。新的方法，特別是涉及用同位素標記的肽進行內部標準化的方法，使得質譜法(MS)提供了這樣的定量肽和蛋白質的分析(如現在MS用于測定低分子量藥物代謝產物)。然而，當應用于非常復雜的混合物時，如那些自全血漿蛋白消化到肽的的復雜混合物時，存在著MS動態范圍和試驗敏感性的問題。本發明通過以下方式處理了這一問題：提供對敏感性的改進，及有效平衡了含有高量及低量蛋白質樣品的消化液中監控肽的豐度，從而使得可同時測定復雜樣品中的低量和高量蛋白。

能幫助擴增診斷學上有用的蛋白質組的一個重要的進展是同時將許多蛋白測定一起用作一個組，以便于將模式的改變與疾病或治療關聯，而不是依賴于單獨解釋的單個蛋白標記物。幾種科研工作對該方法提供了數據支持。(參見Jellum、Bjornson、Nesbakken、Johansson和Wold，J?Chromatogr?217：231-7，1981。)人們努力使用后一種方法在后標準化20種分析物的血清化學組中檢測疾病標志物，但可能是由于該分析物的間接特性及其較少的數量，該努力收效甚微。

一段時間以來已建立了多變的蛋白質標記物的概念和使用方法。需要說明的是為什么該方法未曾有效進入到臨床實踐中去。

雖然蛋白質組學可顯示并有時測定許多種蛋白質，現有技術(例如2D凝膠)已難于應用于大量足夠大的樣品來在研究水平上證明臨床相關性。使用現有測驗的另一方法對于確定檢測組的疾病相關性通常太昂貴。在血漿的單個樣品中全部可測得七十種蛋白，但使用單個試驗的商業成本是$10896.30。這樣最終，多分析物診斷的成功與科學工作的成本相同。

質譜法(MS)已解決了通過2D凝膠和其他方法溶解析的蛋白的鑒別問題，并也為復雜蛋白混合物的分析提供了顯得穩定的通用方法。在以后的分類中，可區別兩種通常的方法：第一，對樣品中的蛋白質和肽經其檢測或識別而獲得“無偏見的”發現，及第二，對蛋白質或肽進行定量測定，通常需要某種額外的標準化物。

質譜技術發現復雜樣品中蛋白質的能力依賴于存在通常源于DNA測序工作的大的蛋白質序列數據庫，除了下述一種值得注意的例外。由于這些數據庫越來越全面，至少在理論上該方法為蛋白質發現提供了一種通常的解決方案。到目前為止，MS工作已為蛋白質組問題審查了三種基本的窗口(window)：全蛋白質、通過體外消化蛋白(例如，用胰蛋白酶)獲得的肽片段、及天然存在的肽(低分子量蛋白組或肽組)。

可用稱為SELDI-TOF(為表面強化的激光解吸電離飛行時間)質譜的方法分析全蛋白質，該質譜法是MALDI-TOF(基質強化的激光解吸電離飛行時間質譜)的變體，在該方法中用基于對派生的MS靶的蛋白質親和力的化學分級來將樣品的復雜性降低至全蛋白MS可解析一系列單個峰的水平。該方法的嚴重缺點在于全蛋白MS分析不直接提供基于序列的識別(有許多蛋白質接近給定的質量)，因此沒有其他有效的工作，嚴格意義上說未識別作為標志發現的蛋白質峰。尤其是，沒有離散的識別，一般不可能說明一種峰是一個蛋白質分析物或將測定值轉換為典型的免疫分析形式。然而，由于這已通過基于某些單克隆抗體的成功分析(其中靶蛋白質未識別)清楚顯示，如果該技術允許該分析在任何目標實驗室中重復(現在顯示正在進行的工作)，此點不對臨床使用造成重大限制。