[發(fā)明專利]一種基于組合原理和PCR建立超大容量基因文庫(kù)的新方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910171706.3
• 申請(qǐng)日: 2009-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101792934A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石超;馬翠萍;黃河青;張書圣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C40B30/04
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種在分子進(jìn)化中建立基因文庫(kù)的方法，利用帶有共用接頭的隨機(jī)片段，用PCR的方法將隨機(jī)片段進(jìn)行互補(bǔ)、重疊延伸和重聚，得到一個(gè)隨機(jī)組合的龐大基因文庫(kù)。

背景技術(shù)

酶作為生物催化劑有催化效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)。美國(guó)能源部、商業(yè)部等部門預(yù)測(cè)：生物催化劑將成為21世紀(jì)化學(xué)工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要工具。它是工業(yè)生物技術(shù)的核心，但是天然酶的性質(zhì)很難適應(yīng)各種工業(yè)生產(chǎn)的條件。酶的定向進(jìn)化(Directed?Evolution，DE)是為滿足這種需求而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的有效途徑。

酶(或蛋白質(zhì))的定向進(jìn)化又稱酶的體外分子進(jìn)化(In?vitro?Molecular?Directed?Evolution)，是在實(shí)驗(yàn)室中模擬達(dá)爾文進(jìn)化的過(guò)程，以改進(jìn)的誘變技術(shù)結(jié)合重組手段，建立突變體文庫(kù)，創(chuàng)造分子的多樣性，再結(jié)合靈敏的高通量篩選技術(shù)，可以迅速得到理想的非天然酶(或循環(huán)進(jìn)入下一輪定向進(jìn)化中以期得到更為理想的非天然酶)。定向進(jìn)化與蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)不同，它不用事先了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、保守位點(diǎn)、催化機(jī)制等，并且與自然進(jìn)化相比，進(jìn)化的時(shí)間縮減到數(shù)月甚至是數(shù)周。定向進(jìn)化技術(shù)已被用于上百個(gè)酶的進(jìn)化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、藥業(yè)的生產(chǎn)上產(chǎn)生了巨大影響。

酶的定向進(jìn)化需要兩項(xiàng)重要的支撐技術(shù)：一是要建立具有足夠量的變異體的突變體文庫(kù)，為進(jìn)一步篩選提供豐富的素材；二是要有合適的篩選系統(tǒng)，可以快速的從眾多的變異蛋白質(zhì)中篩選到符合目標(biāo)的蛋白質(zhì)。建立突變體文庫(kù)的關(guān)鍵是創(chuàng)造基因的多樣性，易錯(cuò)PCR(Error-prone?PCR)和DNA重組(DNARecombination)是現(xiàn)有的主要方法。易錯(cuò)PCR是通過(guò)改變反應(yīng)體系中Mg²⁺和dNTPs的濃度向相應(yīng)DNA分子中隨機(jī)引入錯(cuò)配堿基來(lái)獲得酶分子的隨機(jī)突變體，然后經(jīng)過(guò)多重這樣的小步幅迭代變異(每次1-2個(gè)氨基酸)，以相繼式或組合式累積起來(lái)的變異獲得理想的酶功能。易錯(cuò)PCR在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性：一是變異速度慢；二是僅引入點(diǎn)突變；三是涉及的基因片段太短(小于800bp)。另一種產(chǎn)生突變的主要方法是體內(nèi)同源基因的隨機(jī)拼接或家族重排。目前，DNA重組的方法很多，如DNA改組(DNA?Shuffling)、交錯(cuò)延伸PCR(StEP)、外顯子DNA隨機(jī)重組、隨機(jī)引物體外重組(RPR)、漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(ITCHY)、隨機(jī)插入與刪除(RID)，這些方法與易錯(cuò)PCR不同的是DNA重組依靠的是混合和連接親本DNA的眾多片段來(lái)產(chǎn)生突變體，稱作有性PCR。在眾多的DNA重組方法中，DNA改組得到了廣泛的應(yīng)用，其基本原理為：首先利用PCR或酶切的手段獲得基因庫(kù)里的一組同源基因或突變體基因片段，然后用化學(xué)(DNaseI)或物理(超聲波)的手段將其隨機(jī)切斷成一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的小片段，由于這些小片段之間具有一定的同源性可相互為引物，通過(guò)重聚PCR(Re-assembly?via?PCR)的途徑延伸為具有全長(zhǎng)的基因片段。當(dāng)來(lái)自一種基因拷貝的小片段與另一種拷貝的小片段相互為引物時(shí)，即可發(fā)生模板的移位。這種方法不僅可以創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會(huì)，獲得導(dǎo)致更大變異的突變體，還能將父本基因的優(yōu)勢(shì)集為一體。

雖然，DNA改組及其衍生技術(shù)是獲得有益突變體的有力工具，但它們通常不能用于重組同源性低于70％-80％的序列。自然界中存在很多種蛋白質(zhì)，其序列不同(同源性低)而空間結(jié)構(gòu)相似，為了對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行重組，Benkovic研究組建立漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(ITCHY)方法來(lái)產(chǎn)生不依賴于DNA序列同源性的重組文庫(kù)。Sieber等提出了不依賴序列同源性的蛋白質(zhì)重組(SHIPREC)方法，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收單基因長(zhǎng)度隨機(jī)片段，保證了子代嵌合體長(zhǎng)度的保守性，使交叉保持了適當(dāng)?shù)男蛄衅ヅ洌饕l(fā)生在結(jié)構(gòu)上相關(guān)的位點(diǎn)，交叉點(diǎn)處的兩個(gè)氨基酸仍處于它們?cè)谟H本蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的位置，從而提高了文庫(kù)中功能雜合子的比例。Liu等提出的非同源隨機(jī)重組(NRR，nonhomologous?random?recombination)方法，通過(guò)連接酶的隨機(jī)連接，可以對(duì)兩個(gè)非同源的親本基因進(jìn)行隨機(jī)重組。

已有的建立突變體文庫(kù)的方法對(duì)酶的進(jìn)化尤其是對(duì)生產(chǎn)適用于醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)的生物催化劑起到了巨大的推動(dòng)作用，但這些方法只能依賴現(xiàn)有的基因進(jìn)行改造和篩選，難以開(kāi)拓新的序列空間(尤其是功能改變較大時(shí))，對(duì)于在自然界中不存在的篩選目標(biāo)，如對(duì)于新出現(xiàn)的病毒的預(yù)防或者對(duì)于非自然的性狀的篩選，則很難通過(guò)利用原有基因的改造來(lái)實(shí)現(xiàn)。