[發(fā)明專利]一種制備重組人PDCD5的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910169934.7
• 申請(qǐng)日: 2009-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN101643763A
• 公開（公告）日: 2010-02-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張炎;張英;唐治華;張杰;白敏姿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京天廣實(shí)生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/02
• 分類號(hào): C12P21/02;C07K14/435;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種制備具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡活性的重組人PDCD5(programmed?cell?death?5)的方法。

背景技術(shù)

PDCD5是北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部在國(guó)際上首先發(fā)現(xiàn)的新的程序性細(xì)胞死亡相關(guān)基因，編碼125個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。1999年在國(guó)際雜志發(fā)表論文時(shí)曾命名為TFAR19(TF-1cell?apoptosis?related?gene?19)，2002年國(guó)際人類基因命名委員會(huì)將其統(tǒng)一命名為PDCD5。研究證明，PDCD5是一個(gè)新的抑癌基因，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過結(jié)合組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶Tip60發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明重組人PDCD5蛋白對(duì)腫瘤的的化療具有明顯的增敏效應(yīng)，其本身未發(fā)現(xiàn)毒副作用。

中國(guó)專利公開號(hào)CN1218833A公開的發(fā)明專利申請(qǐng)“具有細(xì)胞凋亡促進(jìn)活性的多肽”，涉及PDCD5的制備，重組PDCD5為包涵體形式的原核融合表達(dá)，通過變性溶解和稀釋復(fù)性后，酶解釋放出目的蛋白，再用陰離子交換柱DEAE分離純化。中國(guó)專利公開號(hào)CN101214371A公開的“人重組蛋白PDCD5在制備腫瘤化療增敏藥中的應(yīng)用”，重組PDCD5為原核可溶性表達(dá)，目的蛋白PDCD5的表達(dá)量?jī)H占菌體可溶性蛋白的8％，在小試水平經(jīng)離子交換和疏水2步層析，目的蛋白電泳純度大于95％。上述2個(gè)專利中均未涉及重要純化參數(shù)如pH、離子強(qiáng)度和純化評(píng)價(jià)指標(biāo)如收率等的描述。大腸桿菌采用可溶性表達(dá)形式表達(dá)重組蛋白可以避免目的蛋白的變復(fù)性過程，但菌體破碎液中目的蛋白混雜了大量的可溶性菌體蛋白，給后續(xù)目的蛋白的分離純化帶來了很大的困難，特別在工業(yè)化高密度發(fā)酵純化生產(chǎn)時(shí)。本發(fā)明主要體現(xiàn)在，宿主細(xì)胞經(jīng)流加-批式高密度發(fā)酵，菌體密度和目的蛋白表達(dá)量提高；通過調(diào)節(jié)菌液或細(xì)胞破碎液的pH至酸性，可以沉淀大部分的雜蛋白，方便了后續(xù)的層析分離，而不影響目的蛋白的活性和收率；在層析分離精制時(shí)選用陰離子、陽離子或疏水作用介質(zhì)的任意2種介質(zhì)組合，目的蛋白的純度和收率可分別達(dá)到99％和70％以上；且本工藝可放大至中試生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是，提供一種制備基因重組人PDCD5的方法，該方法不僅使重組人PDCD5的表達(dá)量高，而且產(chǎn)率和純度高，并可放大中試生產(chǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：表達(dá)重組人PDCD5的基因工程菌流加-批式高密度發(fā)酵、工程菌破碎、目的蛋白粗提、層析分離精制。

重組人PDCD5工程菌流加-批式高密度發(fā)酵的方法為：

將表達(dá)重組人PDCD5的工程菌接種于搖瓶中的LB、2×YT、SOB或SOC培養(yǎng)基，置30-37℃振搖過夜。將菌液接種于發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng)。自動(dòng)控制溫度于37℃，用氨水自動(dòng)流加控制pH于6.8-7.1。發(fā)酵初期通過增加通氣量、通氧量和逐漸增加轉(zhuǎn)速維持溶氧飽和度于20％-50％。至溶氧明顯上升時(shí)開始流加氮元和碳元，氮元包括酵母提取物、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解物等，碳元包括葡萄糖、蔗糖等，流加速度參考溶氧、菌體密度OD₆₀₀值和尾氣分析。至OD₆₀₀達(dá)70-90時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度控制在0.05-0.35mmol/L。繼續(xù)流加培養(yǎng)3-6小時(shí)，至OD開始下降、溶氧上升、OUR和CER下降時(shí)結(jié)束發(fā)酵，此時(shí)菌體密度OD₆₀₀平均達(dá)120左右。離心發(fā)酵液收集菌體。

表達(dá)重組人PDCD5工程菌的破碎和重組人PDCD5粗提的方法為：

用1∶2至1∶10(體積比，如無特殊說明，以下同)的去離子水重懸離心沉淀的菌體，用鹽酸、硫酸或磷酸調(diào)節(jié)菌液pH至1.5-5.0，優(yōu)選pH?1.5-4.0，首選pH?2.0-3.0，勻質(zhì)機(jī)破碎。先在30-50Mpa壓力下預(yù)破碎菌體一次，然后在100～130Mpa壓力下破碎2-3次。離心，10000rpm，20min，收集含重組人PDCD5的上清液。

或用1∶2至1∶10的去離子水重懸離心沉淀的菌體，勻質(zhì)機(jī)破碎。先在30-50Mpa壓力下預(yù)破碎菌體一次，然后在100～130Mpa壓力下破碎2-3次。用鹽酸、硫酸或磷酸調(diào)節(jié)菌體破碎液pH至1.5-5.0，優(yōu)選pH?1.5-4.0，首選pH?2.0-3.0，離心，10000rpm，20min，收集含重組人PDCD5的上清液。

將離心收集的含重組人PDCD5上清液的pH調(diào)至6.0-8.0，優(yōu)選6.5-7.5，首選6.8-7.2，進(jìn)一步沉淀部分雜蛋白，上清液SDS-PAGE電泳重組人PDCD5的含量為50-60％。

重組人PDCD5層析分離的方法為：