[發明專利]絨山羊PDK1基因cDNA編碼區核苷酸序列

無效

• 申請號: 200910169287.X
• 申請日: 2009-08-26
• 公開（公告）號: CN101993882A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 王志鋼;劉東軍;旭日干
• 申請（專利權）人: 王志鋼;劉東軍;旭日干
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域??本發明涉及從體外培養的絨山羊胎兒成纖維細胞分離的編碼PDK1蛋白的cDNA，更具體地說涉及編碼PDK1蛋白質的cDNA編碼區698bp的核苷酸序列和與它的第2位～第697位核苷酸序列對應的氨基酸序列。

背景技術??細胞生長調控是一個受多因素影響的復雜過程，它不僅受到時間和空間的限制，還受到營養條件和細胞內外環境條件的影響。在營養條件合適并有其它刺激生長的因子存在時，細胞通過生物大分子合成而使得質量和形態都得到增長，此時則表現為生長。

3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent?protein?kinase-1，PDK1/PDPK1)，是一個63KDa的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。作為細胞中很多重要信號通路的中心樞紐，廣泛存在于人的很多組織中。起初，PDK1作為Akt1(PKB)的上游活化激酶而被發現。1997年，Alessi等從兔子的骨骼肌中分離純化了一種蛋白激酶，可以磷酸化PKB的Thr308位點，PKB的活性增加30倍以上。然后他們在一些磷酸肌醇(PIs)存在的條件下檢測該激酶的活性，發現這種活化以一種依賴PIP3或PIP2的方式完成，PDK1也就因此而得名。PKB的充分激活依賴磷酸化Thr308和Ser473氨基酸殘基。一般認為PDK1只可將Thr308位點磷酸化，而活化另一位點Ser473的上游激酶目前尚無定論。

PDK1在激活AGC激酶家族成員中起著重要作用，除PKB外，PDK1還可能活化PKC的很多亞型，S6K(p70?ribosomal?S6?kinases)，RSK(p90?ribosomal?S6?kinases)，SGKs(serum-and?glucocorticoid-inducedkinases)和PKA(protein?kinaseA)等。被PDK1激活的AGC激酶成員具有共同的結構特征，即均含有兩個保守的區域，激酶活性區內的T-loop區(activation-loop)和羧基端的疏水性的H-motif區域(hydrophobicmotif)。前者保守序列為T(F/L)CGT。后者保守序列為FXXF(S/T)(Y/F)，其中X為任意氨基酸。只有這兩個保守區域同時磷酸化，激酶活性才被充分激活。PDK1中類似AGC家族的磷酸化位點Ser241可通過分子間二聚后的交叉自磷酸化促使PDK1活化，這也許可以解釋為什幺哺乳動物細胞中PDK1多為組成性活化。另外，Src作為PDK1的上游激酶可磷酸化Tyr373/376和Tyr9兩個位點。而Tyr9的磷酸化不僅與Src有關，還會受到ROS(reactive?oxygen?species)的影響。

PDK1活化AGC家族成員的機制不盡相同，可大致分為四組。第一組為脂依賴的底物，包括PKB和某些PKC亞型。PKB與細胞膜上的PIP3結合從而實現從胞漿移位至胞膜，并同時完成其構型的轉變，以便處于近膜區的PDK1磷酸化其T-loop上的Thr308位點；在T-loop活化完成的同時，由PDK2(ritor-mTOR)完成對PKB?HM的磷酸化，并在其催化結構域(catalytic?domain)內通過α螺旋形成HM結合位點；最后，已發生磷酸化的HM結合到此位點，促使PKB活化完全。而某些PKC亞型則是通過與佛波醇、甘油二酯、磷脂酰絲氨酸、卵磷脂或PIP3相互作用，轉化為PDK1的底物，從而完成T-loop活化，并且正是這種活化導致了PKC自身HM發生自磷酸化。第二組為磷酸化依賴的底物，包括S6K和SGK。與第一組不同，這種底物的HM先發生磷酸化，然后促使PDK1通過其PIF(PDK1-interacting?fragment)結合區與該底物發生相互作用，進而磷酸化底物的T-loop；第三組為Rho依賴的底物，包括PRK1(PKC-related?kinase)和PRK2。這種底物先通過N端結合Rho的結構域與Rho-GTP發生相互作用，然后導致構型改變，促使PDK1磷酸化其T-loop殘基。第四組為T-loop殘基組成性活化的底物，包括PKA和RSK。

迄今，關于PDK1在哺乳動物細胞生長與增殖中發揮調節作用的研究已在小鼠、大鼠、牛、人和豬等哺乳動物的細胞中開展并取得了許多成果，但尚未見絨山羊細胞中PDK1的研究報道，也未見有絨山羊PDK1基因的cDNA核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。