[發明專利]一種以殼聚糖為載體的固定化方法

有效

• 申請號: 200910169247.5
• 申請日: 2009-08-24
• 公開（公告）號: CN101993867A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 楊仲毅;徐期
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C07K17/10;C12P13/10;C12P13/02;C12P17/06;C12P7/42;C12P7/40;C12R1/46
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技術領域

本發明涉及一種以殼聚糖為載體的固定化方法，特別是用于酶、細胞、菌體、發酵液或蛋白質的固定化方法。

背景技術

固定化是相對于游離酶或細胞而言的。通過化學或物理的手段使目標物質束縛在載體區域中，同時又保持了催化活性并且可以反復利用。固定化后，酶或細胞隨著載體的移動而移動，因而在科研和生產中人們可以通過操作肉眼可見的固體狀的載體而控制不可見的酶和細胞的行為。

固定化的方法主要有吸附法、包埋法和交聯法。決定固定化工藝是否具有實際經濟價值的關鍵性因素是載體的價格和性能。海藻酸鈉、卡拉膠和殼聚糖是研究最多的載體，來源豐富，價格便宜，然而應用到工業化的例子卻不多。這些物質用于固定化的共同程序是制膠、造粒和硬化，其中造粒和硬化可以同時進行。對于固定化的工業應用，顆粒的形狀不是衡量的指標，更加重要的是比表面積、機械強度和過濾性能。上述常規技術還存在一些缺陷。第一個缺陷是造粒技術往往是擠出成型，非常難以實現大規模操作，且顆粒大小極難控制。第二個缺陷是通過上述常規工藝形成的顆粒機械性能差，難以耐受持續的機械攪拌，其彌補方法是裝成酶柱，然而這樣又極大地限制了它的應用范圍，要求反應液必須有一定的流動性能才能應用。第三個缺陷是常規的發酵液固定化手段必須先收菌得到菌體，而許多微生物發酵液過濾困難，采用大規模離心手段收集菌體并非工業化首選，因此工業上不得不采取陶瓷膜等其他手段代替固定化。

以殼聚糖為固定化載體的報道較多。例如，王俊等(王俊等，《化工進展》，2004，23(10)，1117-1120)報道了“以殼聚糖為載體固定化海藻糖合成酶”；趙江等(趙江等，《鄭州工程學院學報》，2004，25(2)，34-37)報道了“胃蛋白酶固定化條件的研究”；蔡俊等(《生物技術》，2003，13(5)：11-12)報道了谷胱苷肽硫轉移酶(GST)的固定化及酶學特性研究；任廣智等(《離子交換與吸附》，2000，16(4))報道了磁性殼聚糖微球用于脲激酶的固定化研究。上述方法都是將殼聚糖先造粒，經過處理后再與目標產物交聯或吸附固定，其中也包括將殼聚糖包裹到磁性顆粒表面的做法，但這種做法難以放大，且成本更高，吸附量更小。上述方法都存在固定化顆粒交聯度不均一，強度不均一的缺點。上述方法應用于發酵液固定化時，都需要將發酵液進行固液分離、收集菌體后再進行固定化操作，固液分離的效果對設備的依賴性較高。

本申請發明人將殼聚糖的絮凝作用與固定化作用相結合，并做了工藝上的改進，形成了一種獨特的固定化工藝。與上述兩種固定化程序不同，本發明中殼聚糖溶液與待固定物質的溶液或懸浮液先交聯成凝膠狀，再通過該凝膠在弱堿性環境下的硬化作用而自動脫水固化，再通過攪拌將凝膠分散成顆粒。分離出顆粒后，濾液澄清，在顯微鏡下濾液中看不到菌體殘留。該顆粒具有很好的強度和過濾性能，通過機械粉碎成更小顆粒后仍保持合適的強度和過濾性能。

尤其需要說明的是，本發明可以直接將發酵液中的菌體或蛋白成分固定化，避免了發酵液工業化收菌的困難，對于工業酶制劑的開發具有很大的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種適合于工業化生產操作的固定化方法。以殼聚糖為載體，與目標物質經充分交聯后，再固化分散成顆粒。本發明具有普遍適用性，可用于酶、細胞、菌體、發酵液及蛋白質等物質的固定化。

本發明通過以下技術方案解決上述問題：

一種以殼聚糖為載體的固定化方法，其特征在于，包括以下步驟：

a.制備待固定的殼聚糖溶液：

1)向殼聚糖中加入酸，配制成殼聚糖溶液，

2)準備待固定物質的溶液或懸浮液，

3)將上述1)的溶液與待固定物質的溶液或懸浮液直接混合；

b.交聯：將交聯劑與上述步驟a得到的混合物混合，進行反應，反應完成后的混合物呈凝膠狀；

c.向上述步驟b得到的凝膠狀混合物中加入堿性物質，攪拌使凝膠固化分散成顆粒狀，收集顆粒狀的交聯殼聚糖；

d.可選擇地，通過粉碎、切割或者過篩方法將上述步驟c得到的交聯殼聚糖再加工成各種形態的顆粒或粉末。

本發明的固定化方法中，所述待固定物質選自酶、細胞、菌體、發酵液或蛋白質。

一般常用的酸都可以實現本發明，優選自冰醋酸、鹽酸或硫酸，更優選體積比0.1-80％的冰醋酸水溶液。

一般常規的堿性物質都可以實現本發明，優選能與殼聚糖溶液反應生成氣體的物質，如碳酸鈉和/或碳酸氫鈉的固體或溶液，這樣可以達到更好的固定化效果，又不會劇烈改變pH而對生物活性造成大的影響。