[發(fā)明專利]17-去甲基雷帕霉素及其類似物、它們的制備方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910168702.X
• 申請日: 2005-08-11
• 公開（公告）號: CN101805748A
• 公開（公告）日: 2010-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬修·A·格雷戈里;克里斯蒂娜·J·馬丁
• 申請（專利權(quán)）人: 比奧蒂卡科技有限公司
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N15/74;C12R1/29;C12R1/045;C12R1/465
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 岑曉東

1.用于制備包括編碼工程改造的雷帕霉素聚酮化合物合酶的生物合成簇的重組菌株的方法，其中，模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域被丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域所取代。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述模塊10的甲基丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域被來自下列簇中的一種的丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域所取代：雷帕霉素，莫能菌素，F(xiàn)K506，紅霉素，F(xiàn)K520，兩性霉素，安哥拉霉素，泰樂菌素，′hyg′，F(xiàn)K523，meridamycin，antascomicin，F(xiàn)K525和tsukubamycin。

3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域選自下列簇中的一種：雷帕霉素，莫能菌素和FK506。

4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述AT結(jié)構(gòu)域選自下組：來自雷帕霉素模塊2的AT結(jié)構(gòu)域，來自莫能菌素模塊3的AT結(jié)構(gòu)域，來自莫能菌素模塊6的AT結(jié)構(gòu)域，來自莫能菌素模塊8的AT結(jié)構(gòu)域，來自FK506模塊3的AT結(jié)構(gòu)域和來自FK506模塊7的AT結(jié)構(gòu)域。

5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述丙二酰-CoA特異性AT結(jié)構(gòu)域來自雷帕霉素的模塊2。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項的方法，其中所述方法包括以下附加步驟：

(a)分離作為具有合適的側(cè)翼限制位點的單一DNA片段要導(dǎo)入的AT，

(b)利用合適的限制位點擴增并且分離與目標AT的側(cè)翼序列同源的DNA序列的區(qū)域，

(c)將步驟(a)和(b)所述三種DNA片段連接在一起，以得到LHS同源性，隨后是供體AT結(jié)構(gòu)域，隨后是RHS同源性的框內(nèi)序列，

(d)將來自步驟(c)的完整序列導(dǎo)入用于導(dǎo)入宿主菌株的載體，以得到最終質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包括：

i)用于接合的oriT，

ii)一種或多種抗性標記，

iii)溫度敏感型復(fù)制起點，從而可通過在37℃培養(yǎng)來選擇整合體，

和

iv)大腸桿菌復(fù)制起點，

(e)使用上面(d)中所述的最終質(zhì)粒通過接合來轉(zhuǎn)化所述宿主菌株，

(f)通過對相關(guān)抗生素的抗性選擇轉(zhuǎn)化體，

(g)通過在37℃培養(yǎng)，用抗生素選擇來產(chǎn)生初級整合體，

(h)同樣在37℃，通過在不進行抗生素選擇的條件下的生長來篩選次級重組體，

(i)通過產(chǎn)生目標產(chǎn)物的能力鑒定需要的菌株，和

(j)通過標準方法任選地驗證所述菌株的遺傳學(xué)。