[發明專利]通過包括熱循環的多重置換擴增來擴增靶核酸序列的方法

無效

• 申請號: 200910165728.9
• 申請日: 2009-08-06
• 公開（公告）號: CN101705273A
• 公開（公告）日: 2010-05-12
• 發明（設計）人: 李周遠
• 申請（專利權）人: 三星電子株式會社
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 金擬粲

技術領域

本發明的示例性實施方式涉及通過多重置換擴增來擴增靶核酸序列的方法，更具體而言，涉及包括熱循環的通過多重置換擴增來擴增靶核酸序列的方法。

背景技術

已知各種擴增核酸的方法。這些方法包括聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、自主序列復制(3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、使用Qβ復制酶的擴增和多重置換擴增(MDA)。

MDA是基于通過多元引物進行的靶核酸序列的鏈置換擴增。在MDA中，產生復制鏈并且在復制期間，至少一條復制鏈通過另一復制鏈的鏈置換復制而從靶核酸序列上置換下來。對于MDA而言，可利用的引物可包括與靶序列的一條鏈互補的引物組以及與靶序列的另一條鏈互補的引物組。而且，所述引物可為一組具有隨機序列的引物。此外，所述引物可為這樣的一組引物，該組中每一引物僅與靶序列的一條鏈雜交。

相關技術公開了一種擴增靶核酸序列的方法，其中該方法包括使一組引物、DNA聚合酶以及靶樣品接觸，并且在促進該靶序列的復制的條件下溫育該靶樣品。該靶樣品未經歷變性條件，并且該靶序列的復制產生復制鏈，其中在復制期間，所述復制鏈中的至少一條通過另一復制鏈的鏈置換復制而從該靶序列上置換下來。

MDA在基本上恒溫的溫度下進行，并且溫育在足以促進引物與靶序列的雜交的低溫下進行。也就是說，為了促進引物的雜交，在低于聚合酶活性最適溫度的溫度下進行溫育。結果，只有在初始的變性和退火階段結合、并且在相應位置處結合的引物發生擴增，因而可發生擴增偏差，由此降低擴增效率。

發明內容

本發明的示例性實施方式包括通過多重置換擴增(MDA)，包括熱循環，來擴增靶核酸序列的方法。

其它各方面有些在隨后的說明中進行闡述，有些可從該說明中明晰，或者可通過所介紹的實施方式的實踐而獲知。

本發明的示例性實施方式可包括擴增靶核酸序列的方法，其中該方法包括：使一組引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接觸；和溫育該溶液以復制該靶核酸序列，其中該靶核酸序列的復制產生復制鏈并且在復制期間，所述復制鏈中的至少一條通過另一復制鏈的鏈置換復制而從該靶序列上置換下來，其中進行所述溫育時，在DNA聚合酶活性最適溫度范圍與促進所述引物與該靶序列雜交的溫度范圍之間進行熱循環。

附圖說明

圖1的電泳圖像顯示在30℃或60℃擴增靶序列時、或者在約30℃與約60℃之間進行熱循環時的擴增結果。

圖2顯示靶序列按照圖1所示在約30℃與約60℃之間進行熱循環時的擴增結果和使用對照產物獲得的結果。

具體實施方式

現在將詳細提及示例性實施方式，其實施例說明于附圖中，其中相同的附圖標記始終表示相同的要素。在這方面，當前的各實施方式可具有不同的形式并且不應解釋為限于本文中所進行的說明。因此，僅在下面通過參照附圖描述這些實施方式以解釋本說明的各方面。

根據本發明實施方式的擴增靶核酸序列的方法包括使一組引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接觸。

引物可具有約5至約20bp的長度。解鏈溫度Tm可根據所使用的引物的長度和核苷酸組成以及反應溶液中的組分(例如陽離子的濃度)而不同。本文中所用術語“解鏈溫度Tm”是指核酸分子的多份拷貝中一半核酸鏈處于雙鏈狀態而另一半處于“無規卷曲”狀態時的溫度。例如，當引物具有約5至約20bp的長度并且引物的核苷酸是天然核苷酸時，Tm可為約10℃至約80℃。引物可具有約5至約8bp的長度。引物可具有約6bp的長度。除了天然核苷酸之外，引物還可包括修飾的核苷酸。例如，引物可包括至少一個修飾的核苷酸并且因此是耐核酸酶的，例如是耐外切核酸酶的。修飾的核苷酸可為生物素化核苷酸、熒光標記的核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且，引物可用可檢測的標記物進行標記。引物組可包括多個引物。引物組可包括與靶核酸的同一條鏈互補的兩個或更多個引物，例如，三個或更多個引物、或者四個或更多個引物、或者五個或更多個引物。引物組還可包括至少一個與靶核酸的另一條鏈互補的引物。引物組可包括多個引物并且各引物可包括互補部分，其中這些引物的這些互補部分各自與靶核酸的不同部分互補。引物組可包括具有隨機核苷酸序列的引物。在本發明的實施方式中，引物可以是長度為5bp、6bp、7bp或8bp的隨機引物、或其混合物。