[發(fā)明專利]熱穩(wěn)定的高溫酸性α-淀粉酶基因、工程菌、重組酶及應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910163375.9
• 申請(qǐng)日: 2009-08-13
• 公開（公告）號(hào): CN101691576A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王淑軍;秦松;陸兆新;呂明生;房耀維;劉姝;劉紅飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/56
• 分類號(hào): C12N15/56;C12N9/28;C12N15/63;C12N15/66;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶基因，其特征在于，它具有序列表中的SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列。

2.一種熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶，其特征在于，它具有序列表中SEQ?IDNO.1所示的堿基序列編碼的蛋白序列。

3.一種堿基序列的表達(dá)載體，其特征在于，它是包括權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶基因的堿基序列的表達(dá)載體pEt-28a-His₆-amy。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，它由下列方法制得：將權(quán)利要求1所述的熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶基因的堿基序列擴(kuò)增，與質(zhì)粒pMD18-T載體連接，得到克隆載體pMD18-T-amy，再將克隆載體pMD18-T-amy和表達(dá)載體pEt-28a-His₆分別經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后連接得到表達(dá)載體pEt-28a-His₆-amy。

5.一種用于表達(dá)權(quán)利要求2所述的熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(Escherichia?coli?EHJ21)CGMCC?No.2157，其特征在于，它是將權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)載體pEt-28a-His₆-amy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)中得到的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(Escherichia?coli?EHJ21)CGMCC?No.2157。

6.一種用權(quán)利要求5所述的基因工程菌株大腸埃希氏菌EHJ21(Escherichia?coli?EHJ21)CGMCC?No.2157產(chǎn)重組熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶的制備方法，其特征在于，其步驟如下，

(1)將基因工程菌株以1％的接種量接入裝有50mL?LB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在37℃，180轉(zhuǎn)/分下?lián)u床培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)菌液的OD₆₀₀達(dá)到1.0時(shí)，再加入濃度為1mmol·L^-1誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)4h，得發(fā)酵液；

(2)將發(fā)酵液13000×g離心5min后去掉上清，用3mL生理鹽水懸浮細(xì)胞，13000×g離心5min去掉上清，重復(fù)此操作一次；用3mL蒸餾水充分懸浮細(xì)胞，0℃水浴中經(jīng)超聲波破碎5min，13000×g離心10min取上清液即得重組熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶的粗酶液；

(3)將制取的粗酶液用80℃水浴中處理30min，13000×g離心10min取上清液，再用DEAE離子交換層析和Ni親和層析的方法對(duì)重組酶進(jìn)行純化，即得。

7.一種如權(quán)利要求6所述方法得到的重組熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶，其特征在于：該酶的分子量為50KD；適合作用溫度90℃，在95℃和100℃分別有90％和70％的酶活力；該酶熱穩(wěn)定性不依賴于Ca²⁺，酶液分別在80、90、100℃保溫5h后，其殘余酶活分別為82％、77％和69％；該酶的作用pH范圍為pH?4～9，適合作用pH為5.0～5.5，在pH?4.5有81％的殘余酶活；在80℃和90℃下該酶在pH?5～9和pH?5～8的范圍內(nèi)穩(wěn)定，該酶在100℃1h，pH?5～7.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定；金屬離子K⁺、Na⁺對(duì)酶有激活作用，Hg²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺能夠抑制酶活性；1mmmol·L^-1和5mmmol·L^-1N-溴代丁二酰亞胺對(duì)酶的活性具有抑制作用；該酶的Km為45mg·mL^-1，Vmax為9mg·ml^-1·min^-1；該酶分解馬鈴薯淀粉為麥芽糖和麥芽三糖。

8.一種如權(quán)利要求7所述重組熱穩(wěn)定高溫酸性α-淀粉酶在淀粉水解中的應(yīng)用。