[發明專利]水稻抗稻瘟病基因Pi 25編碼區及其應用

有效

• 申請號: 200910155266.2
• 申請日: 2009-12-10
• 公開（公告）號: CN101824418A
• 公開（公告）日: 2010-09-08
• 發明（設計）人: 吳建利;陳潔;莊杰云;施勇烽
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 周希良;徐關壽

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pi25編碼區的分 離克隆與應用。

背景技術

水稻是我國重要的糧食作物，擔負著全國95％以上人口的口糧。然而水稻在種植過程 中，經常會受病害的危害，造成嚴重減產。稻瘟病是由子囊菌Magaporthe?oryzea引起的水 稻重要病害，已在85個國家中發現此病害。據統計，在1975-1990年間，由稻瘟病菌引起 的糧食損失占全球總產量的11-30％，約157億噸。從1980到2002年的22年間，我國四 川省年均發生稻瘟病280萬畝，年均損失稻谷6000萬公斤。2005年黑龍江省稻瘟病發生 面積超過66.67萬hm²，占該省水稻播種面積的1/3。目前，稻瘟病的防治主要采用化學防 治和抗病新品種培育兩種途徑。化學防治通常成本高、效果差而且污染環境；而新品種往 往由于病菌小種致病力的快速演變，抗病性無法長期穩定維持，因此，發掘稻瘟病廣譜、 持久抗性新基因，培育持久高抗品種，是最經濟有效的病害控制措施。

開展抗瘟育種，闡明寄主的抗性機制是解決如何培育廣譜，持久性抗性品種的關鍵問 題之一，而發掘、鑒定和克隆抗病基因是抗瘟育種應用的前提。迄今，國內外已至少鑒定 了67個稻瘟病抗性等位基因，座落于水稻基因組的58個位點上，只有第3染色體上尚未 定位到抗性基因。其中第6、11和12染色體上定位到的基因最多，且成簇分布。到目前為 止，已經克隆的稻瘟病抗性等位基因有9個：Pi?b、Pi?ta、Pi2、Pi?z-t、Pi?9、Pid2、Pi36、 Pi37和pi21，分別定位于第2、12、6、6、6、6、8、1和4染色體，其中Pi?2、Pi?z-t和 Pi9為同一座位上的基因，但從物理位置上不是同一座位上的基因；除Pid2是編碼一個 受體類激酶外，pi21編碼一個富含脯氨酸的蛋白且具水平抗性，其余7個基因均編碼 NBS-LRR蛋白。

Pib是第一個被克隆的稻瘟病抗性基因，位于第二染色體長臂末端，該基因大小為 3753個堿基，具有4個內含子，屬于NBS-LRR類型的抗性基因，其編碼的蛋白可能與無 毒基因產物在細胞質中識別，從而誘發水稻的防衛反應。正常情況下，Pib少量表達，當 病原菌存在時，表達量增高，當溫度改變或沒有光照時，該基因的表達量也增加。Pib基 因屬于小家族成員之一，起源于東南亞秈稻，在日本得到廣泛應用，對日本絕大多數小種 表現高抗，不過，目前尚未證明它是一個廣譜稻瘟病抗性基因。 Pi?ta來源于菲律賓秈稻Tadukan，該基因是一個單拷貝基因，編碼一個含928個氨基酸殘基 的細胞質受體，該基因在抗病品種和感病品種918位置上僅僅存在一個氨基酸的差異，但 他們都是低量組成性表達。Pita也屬于NBS-LRR類型的抗性基因，不過其C末端雖然富 含亮氨酸，但不屬于典型的LRR結構。

Pi9，Pi2和Piz-t三個稻瘟病抗性基因均位于第6染色體上，都屬于NBS-LRR類基 因，具有較廣的抗譜。Pi?2與Piz-t高度同源，兩種之間僅有八個氨基酸不同，分布在三 個保守的LRR結構區內。此外，不同于大部分NBS-LRR基因的NBS區激酶2N端包含一 個內含子，這三個基因的內含子不在NBS區內，而分別位于NBS區之前與LRR區之后， 有可能表明Pi2/Pi?9/Pi?z-t基因家族的進化獨立于其他NBS-LRR基因。

Pid2基因來源與我國水稻品種地谷，與以往所克隆的NBS-LRR類抗稻瘟病基因不同， 該基因編碼一個類受體激酶蛋白，同時具有一個胞外域(B-lectin)和胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶 域。Pid2是一個組成性表達的單拷貝基因，同時抗感兩個等位基因僅在第441氨基酸位置 上有差異。Pid2包含一個細胞外的凝集素域可能是作為受體在細胞外與更多的配體結 合，反應了該基因可能存在不同的抗性機制，包括克隆更多類似的基因。

Pi36是一個單拷貝基因，位于第8染色體上的一個17Kb的區間內，是一個典型的 NBS-LRR基因，編碼由1056個氨基酸殘基組成的蛋白質，在抗性品種中組成性表達， 其抗感品種的等位基因僅在第590氨基酸位置上有差異。