[發明專利]一種檢測慶大霉素殘留的免疫膠體金試劑板的制備方法

無效

• 申請號: 200910154330.5
• 申請日: 2009-11-27
• 公開（公告）號: CN101726598A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 張少恩;桑麗雅;卜令杰;邵偉
• 申請（專利權）人: 杭州南開日新生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/566;G01N21/78;G01N33/543
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技術領域

本發明涉及一種檢測乳制品中抗生素殘留試劑板的制備方法，具體涉及一種檢測慶大霉素藥物殘留的免疫膠體金試劑板的制備方法。

背景技術

慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細菌，由于其抗菌譜廣、療效佳、價格低廉而廣泛應用于獸醫臨床和動物飼料添加劑。但是慶大霉素在應用過程中易產生毒副作用，大劑量不規范使用導致動物性食品中的藥物殘留超標會對人體健康造成嚴重危害，產生腎毒性，耳毒性，肌肉阻滯，過敏反應等一系列毒副作用。我國農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定慶大霉素在乳制品中的殘留限量標準為100ng/mL。

目前，對于慶大霉素藥物殘留的檢測方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析法常用的有高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜/質譜聯用分析法(LC-MS)，特異性好、準確率高，是各大檢測機構對檢測樣本進行確證的首選方法。但理化分析法存在對設備、環境、操作技能等要求，不利于大規模樣本篩選，因而不適用于廣大基層部門。免疫分析法常用的有酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫層析法(GICA)，ELISA法檢測量大，操作相對簡單，越來越多地被用于動物性食品中抗生素殘留的檢測，但是整個操作時間仍需要1-2h，且需用到特殊儀器設備，具有一定局限性。GICA法靈敏、快速、特異、簡便，近年來倍受國內外學者關注，是今后慶大霉素殘留快速檢測的發展方向。

發明內容

本發明的目的在于提供一種靈敏度高，特異性好，簡便快速，生產成本低的慶大霉素免疫膠體金試劑板的制備方法。

本發明試劑板由上下兩塊塑料模板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成。

其中樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有1-2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應時間，樣品墊上的緩沖體系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結合墊上的金標抗體順利發生反應。

膠體金結合墊上包被有抗慶大霉素單克隆抗體與膠體金的結合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有慶大霉素-載體蛋白偶聯物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質控線。偶聯慶大霉素的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)等。抗慶大霉素克隆抗體為可以識別慶大霉素的免疫球蛋白或其片段。

本發明試劑板的各部分組成成分與功能如下：

塑料模板，起固定試紙條及標示功能區(加樣孔、檢測區、控制區)的作用

背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。

樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。

膠體金結合墊由聚酯膜制成，其上標記有抗慶大霉素單克隆抗體與膠體金的結合物，是樣品溶液中的有效成分與金標抗體發生反應的場所。

硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。

吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。

本發明試劑板具有如下有益效果：

(1)特異性好。本發明試劑板對慶大霉素的交叉反應率為100％，對其他種類的抗生素包括鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素的交叉反應率均低于1％，可見，本發明試劑板對慶大霉素有高度專一性。

(2)靈敏度高。本發明試劑板對原奶中慶大霉素的檢出限為50ppb(ng/mL)，可以滿足我國農業部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對慶大霉素在乳制品中最高殘留限量100ng/mL的規定要求。

(3)操作簡單快捷，不依賴任何實驗設備，不需任何專業培訓。本發明試劑板將反應所需的大部分原料整合到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短了檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘內即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線的顏色深淺讀取結果，檢測過程無需特殊儀器輔助，普通人員均可操作，不需要專業培訓，極易推廣使用。

(4)成本低，效益好。本發明試劑板生產工藝成熟、流程簡單，生產成本低廉，投資少，收效快。

附圖說明

圖1為慶大霉素免疫膠體金快速檢測試劑板結構示意圖，其中1為樣品墊，2為膠體金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為質控線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC板。