[發明專利]基于兔單克隆抗體的環丙沙星殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒

無效

• 申請號: 200910153255.0
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN101699292A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發明（設計）人: 鄭曉冬;黃斌;劉娜;陸蕾;倪庚
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/52
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及試劑盒，尤其涉及一種基于兔單克隆抗體的環丙沙星殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒。

背景技術

環丙沙星(環丙氟哌酸，ciprofloxacin，CPFX或CIP)，化學名1-環丙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸。其為廣譜高效藥，它對G^-桿菌的殺傷力特強，對耐藥菌引起的嚴重感染也有效，是第三代氟喹諾酮類抗菌藥物中抗菌活性較高的一種。該類藥物吸收迅速、生物利用度高體內分布廣泛，與其他抗生素無交叉耐藥反應，是預防和治療畜禽細菌性感染及支原體病的有效藥物，其MIC在1μg/ml以下。但環丙沙星作為一種人畜共用藥，其殘留通過食物鏈對人體健康危害極大，不利于該類藥物對人類疾病的治療。所以必須十分重視環丙沙星在動物性食品中的殘留問題。因此，開發出一種簡單快速，適用于環丙沙星殘留現場監控的痕量分析具有十分重要的現實意義。

目前對環丙沙星殘留檢測的主要的方法是色譜法。其中HPLC法、液相色譜-串聯質譜法雖然具有靈敏、準確等特點，但該方法前處理較復雜，所需儀器也較昂貴，需要有熟練的技術人員及且其分析周期較長，阻礙其推廣應用。微生物法檢測限過高，特異性不強，不夠靈敏，一般多用于篩選。而免疫分析法具有一定的靈敏度和特異性，而且不需要昂貴的儀器設備，為環丙沙星提供了一個簡單實用的分析檢測途徑。適用于大量樣本的快速檢測，ELISA檢測方法已成為檢測環丙沙星殘留的發展趨勢。

兔單克隆抗體較常規的鼠單克隆抗體具有更多優點。首先，兔子相比于小鼠能識別更多免疫抗原的表位。其次，由于兔脾臟較大，可以進行更多的融合實驗，使得高通量篩選融合細胞成為可能。本試劑盒應用雜交瘤技術得到環丙沙星兔單克隆抗體，開發出基于兔單克隆抗體的環丙沙星間接酶聯免疫試劑盒，國內外均未見有報道。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種具有高特異性、高靈敏度的基于兔單克隆抗體的環丙沙星殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒。

基于兔單克隆抗體的環丙沙星殘留分析酶聯免疫吸附試劑盒包括盒體和設在盒體內的96孔酶標板以及試劑。96孔酶標板內包被有環丙沙星包被抗原，盒內的試劑如下：

(1)洗滌濃縮液；

(2)稀釋濃縮液；

(3)環丙沙星標準溶液；

(4)環丙沙星抗體；

(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體；

(6)底物稀釋液；

(7)底物；

(8)底物顯色液；

(9)反應終止液。

所述的環丙沙星包被抗原為環丙沙星與卵清蛋白的偶聯產物，環丙沙星包被抗原能與抗環丙沙星抗體特異性結合；所述的洗滌濃縮液內含有氯化鈉7～9g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉3～5g、氯化鉀0.1～0.3g、吐溫20?0.5～1ml和去離子水；所述的稀釋濃縮液為含有氯化鈉7～9g、磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉3～5g、氯化鉀0.1～0.3g和去離子水；所述的環丙沙星抗體是兔單克隆抗體，是以兔子為免疫動物，經過雜交瘤技術最終得到的；所述的底物顯色液為3，3，5，5-四甲基聯苯胺配制液；所述的底物稀釋液為pH5.0檸檬酸緩沖液，配方中含有3～6g檸檬酸、6～9g磷酸氫二鈉和去離子水；所述的環丙沙星標準溶液的濃度為：10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL；所述的底物為過氧化氫或過氧化脲；所述的反應終止液為2M硫酸或鹽酸。

本發明在環丙沙星檢測中，IC50值為1.41ng/mL，抑制率曲線線性擬合方程：y＝0.0293x-1.3159，檢測范圍在0.19-10ng/mL之間，最低檢測限是0.095ng/mL。試劑盒中的環丙沙星抗體具有較高的特異性，除了和幾種喹諾酮類小分子有較低交叉率(其對恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、氟羅沙星、培羅沙星的交叉反應率分別為28.8％，13.1％，11％，22.6％，20.4％)，和其他喹諾酮類小分子、抗生素及磺胺類藥物均無交叉反應。

本發明適用于牛奶、尿樣等樣品中環丙沙星殘留的檢測，尤其在牛奶檢測中效果更好。該試劑盒能同時檢測大批量樣本，方便又快速，對現場監控痕量分析具有十分重要的現實意義；同時使檢測成本大大降低，具有潛在的經濟價值。

附圖說明

圖1是環丙沙星單抗間接競爭ELISA標準曲線；

圖2是尿液基質的環丙沙星單抗間接競爭ELISA標準曲線。

具體的實施方式