[發(fā)明專利]抗豬圓環(huán)病毒病shRNA及其設(shè)計(jì)合成法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910152603.2
• 申請(qǐng)日: 2009-09-10
• 公開（公告）號(hào): CN101659953A
• 公開（公告）日: 2010-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周繼勇;繆云根;楊華軍;胡嘉彪;曹晶晶;周芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/11;A61K48/00;A61P31/20
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司
• 代理人: 金 祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行抗豬圓環(huán)病毒病的關(guān)鍵技術(shù)和方法。

背景技術(shù)

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA (double-stranded?RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用 RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功 能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。

RNAi首先由Fire等發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中，他們發(fā)現(xiàn)將dsRNA注入 線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá)，并證實(shí)這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后，所以又稱 RNAi為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(postt?ranscriptional?gene?silencing，PTGS)。隨后人們陸續(xù)在果蠅 (Drosophila)、錐蟲(Trypanosomes)、渦蟲(Planaria)、斑馬魚(Zebrafish)、擬南芥 (Arabidopsis?thaliana)、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象，遺傳學(xué)研究表明RNAi是真 核生物中一種普遍存在且非常保守的機(jī)制，與真核細(xì)胞中許多重要生物學(xué)過程密切相通過 對(duì)RNAi現(xiàn)象的遺傳學(xué)與生物化學(xué)研究，其作用機(jī)制已日漸清晰(見圖1)。

豬圓環(huán)病毒病是最近10年來才發(fā)現(xiàn)的一種新的豬病。研究表明，II型豬圓環(huán)病毒 (PCV-2)不僅是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(PMWS)的病原，而且能夠引起多種豬病。近年 來，由PCV-2引起的疾病主要有PMWS、豬皮炎及腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎等， 另外，豬呼吸與繁殖障礙綜合征、豬細(xì)小病毒、傳染性先天性震顫等均與PCV-2感染有重 要關(guān)聯(lián)。

豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為已知的最小的動(dòng)物病毒之一。PCV 以滾環(huán)方式復(fù)制，呈2O面體對(duì)稱，無囊膜，直徑17nm～22nm，含有1.76kb～2.3kb 的單鏈環(huán)狀DNA，相對(duì)分子質(zhì)量58ku，沉降系數(shù)為52S。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核 苷酸序列，將其分為PCV-1和PCV-2兩個(gè)型，其中PCV-1無致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)及豬 源傳代細(xì)胞系。PCV-2則具有致病性，在臨床上主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征 (PMWS)。目前尚無有效的疫苗可以用來預(yù)防PCV-2的感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗豬圓環(huán)病毒病shRNA及其設(shè)計(jì)合成法和用 途。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)合成抗豬圓環(huán)病毒shRNA的方法，包括 以下步驟：

1)、根據(jù)PCV-2型病毒的基因組序列，以Rep基因或Cap基因?yàn)槟康幕颍x取一段 19bp長的核酸序列；

2)、選取同時(shí)滿足以下3個(gè)條件的核酸序列為候選核酸序列：

A、該核酸序列的GC含量為40％-60％；

B、在15-19的位點(diǎn)中至少有3個(gè)A或T核酸殘基；

C、檢查該19bp核酸序列，保證其不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；

3)、將所得的候選核酸序列與豬圓環(huán)病毒基因組進(jìn)行比對(duì)；以確定該候選核酸序列是 特異性的只針對(duì)目的基因，與其他基因沒有太大的相似性。

本發(fā)明還同時(shí)提供了按照上述方法所得的抗豬圓環(huán)病毒shRNA，其為下述任意一種， 其中的核苷酸序列為5′→3′，Rep為豬圓環(huán)病毒復(fù)制基因，CAP為豬圓環(huán)病毒結(jié)構(gòu)基因：

pSIREN-Rep-1：

正向：

GATCCGTACGGGAGCTTCCAATCTCTTCAAGAGAGAGATTGGAAGCTCCCGTATTTTT

TACGCGTG????(SEQ?ID?NO：1)

反向：

GCATGCCCTCGAAGGTTAGAGAAGTTCTCTCTCTAACCTTCGAGGGCATAAAAAATG

CGCACTTAA????(SEQ?ID?NO：2)

pSIREN-Rep-2：

正向：

GATCCAGTGAGCGGGAAAATGCAGTTCAAGAGACTGCATTTTCCCGCTCACTTTTTT

TACGCGTG????(SEQ?ID?NO：3)

反向：