[發明專利]測定對溶解細胞的抗生素具有抗性的細菌存在的方法

無效

• 申請號: 200910150403.3
• 申請日: 2002-09-02
• 公開（公告）號: CN101580868A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 大衛·詹姆斯·斯奎勒爾;雷切爾·路易絲·萊斯莉;凱文·J·鮑恩
• 申請（專利權）人: 英國國防部
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/14;G01N33/569;C12M1/34;C12R1/445
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司
• 代理人: 丁香蘭

本申請是分案申請，其原申請的國際申請號為PCT/GB02/03990，中國國家申請號為02818402.5，申請日為2002年9月2日，發明名稱為“測定對溶解細胞的抗生素具有抗性的細菌存在的方法”。

技術領域

本發明涉及測定樣品中是否存在一種或一種以上的靶細菌的方法，其中所述的靶細菌對一種或一種以上的溶解細胞的抗生素具有抗性。本發明具體但非限制性地涉及測定在臨床樣品中是否存在一種或一種以上耐甲氧苯青霉素的細菌的方法。

背景技術

對常用抗生素具有抗性的細菌的出現是一個越來越普遍的問題，這個問題與對感染患者的治療密切相關。事實上，這些所謂的超級病菌例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)幾乎對最有效的抗生素都產生了抗性。在醫院環境中，這個問題變得更加嚴重，因為免疫系統弱的患者在醫院內感染對抗生素具有抗性的細菌時，可引發嚴重的并發癥，甚至死亡。因此，在這種環境中需要使感染的危險性降至最低。使這種危險性降至最低的方法之一在于早期測定此類細菌的存在，以對個體和環境進行仔細監測，并且如果必要，進行早期治療。

然而，目前測定對抗生素具有抗性的細菌存在的方法耗時過多，此類方法需要首先培養純態的細菌，然后將該細菌與一系列抗生素接觸，以檢查其生長是否受到抑制。整個過程可能需要至少2天，因而導致在對患者采取最佳治療方案前的經常性的臨界延誤。當然，這種延誤不僅僅對患者的健康不利，而且會使其在醫院環境中逗留更長的時間。

因此，需要一種快速測定存在于患者體內或環境中的、對某種抗生素具有抗性的細菌的方法。

申請人同時待審的專利申請WO?99/37799提供了一種快速測定已知存在于培養物中的特定細菌是否對特定抗生素敏感或具有抗性的方法。然而，該方法的局限性在于其優選需要細菌以純培養物或純分離菌形式存在。然而，所述方法可適用于測定混合培養物中的特定細菌對抗生素的抗性或敏感性。在所述情況下，所述方法通常取決于在用特定抗生素處理前或專門針對該特定細菌的其他作用之前的初步分離步驟。

作為選擇，如果抗生素的作用方式是已知的，所述方法可以揭示已知存在于混合培養物中的特定細菌對抗生素的抗性或敏感性。該方法具體采用以下方法，即，從混合培養物獲得四等分培養物，并在下列情況下分別培養這四等分培養物：i)無抗生素、ii)具有抗生素、iii)存在特異性針對細菌的噬菌體和iv)存在所述抗生素和噬菌體的混合物，然后比較分析這四等分培養物的細胞內腺苷酸激酶的含量，從而揭示已知存在于混合培養物中的特定細菌對抗生素的抗性或敏感性。例如，當與僅用噬菌體培養的樣品相比，用抗生素和噬菌體培養的樣品中的細胞內腺苷酸激酶減少時，基于這種情況可以推斷該細菌對溶解細胞的抗生素敏感。

盡管可假設WO?99/37799中公開的方法可簡明地顯示混合培養物中存在對特定抗生素具有抗性的細菌，但在實踐中尤其是當抗性細菌的濃度低時，還是不能明確并且可靠地獲得這種結果。

甚至，即使能達到上述目的，顯而易見這種測定細菌存在的方法仍需要進行許多重復步驟，包括培養、處理和分析來自混合培養物的不同的至少四份等分樣品。這樣的重復步驟是笨拙的而且增加了出錯的可能性。另外，由于用噬菌體處理混合培養物的等分樣品時需要時間來確保細菌已證實處于其對數生長期，因此所述方法還存在著固有延遲。

因此，始終需要簡單而快速地測定樣品中是否存在耐抗生素的細菌的方法。具體地，始終需要簡單而快速地測定臨床樣品中是否存在耐抗生素的細菌的方法。

發明內容

因此，本發明提供了測定耐抗生素的細菌是否存在于樣品中尤其是臨床樣品中的方法，該臨床樣品是通過例如擦拭感染患者來采集的，該方法簡單、快速并且包括的必需步驟最少。

本發明起源于如下認識：各種細菌通常對溶解細胞的抗生素敏感，因此，首先可有利地丟棄混合培養物中敏感細菌的細胞內物質。

因此，本發明提供了測定樣品中是否存在對溶解細胞的抗生素具有抗性的靶細胞的方法，該方法包括以下依次進行的步驟：

i)在含有溶解細胞的抗生素的培養基中培養樣品，

ii)在含有捕獲劑的固體載體上捕獲未溶解的靶細菌細胞，

iii)使未溶解的靶細菌細胞與能引起其細胞溶解的試劑接觸，

iv)測定是否存在來自所述溶解的靶細菌細胞的細胞內物質。

在本發明的一個實施方案中，本方法還包括在步驟iii)之前，進行洗滌步驟和/或過濾步驟，以除去從對溶解細胞的抗生素敏感的細胞獲得的細胞內物質。