[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910148923.0
• 申請日: 2009-06-02
• 公開（公告）號: CN101724644A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戈梅;李航;黃鶴;魏維;阮林高;楊晟;朱麗;姜衛(wèi)紅;陳代杰;羅敏玉;楊志鈞;夏興;齊曉丹;王天嬌;殷瑜;金文翔
• 申請（專利權(quán)）人: 上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司;浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12P21/02;C12N1/21;C12R1/01
• 代理公司: 上海德昭知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31204
• 代理人: 肖劍南

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說，涉及一種生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法。

背景技術(shù)

如圖1所示，N端去甲萬古霉素是萬古霉素的類似物，僅在一位氨基酸的氨基上比萬古霉素少一個甲基。其抗菌譜與萬古霉素基本相同，但體外活性比萬古霉素高約20％。主要用于葡萄球菌屬(包括甲氧西林耐藥菌)引起的內(nèi)膜炎，肺炎，骨髓炎，敗血癥和軟組織感染等的治療。

華北制藥集團有限責(zé)任公司曾通過傳統(tǒng)的菌種選育的方法篩選得到生產(chǎn)去甲萬古霉素的菌株。但是傳統(tǒng)的菌種選育方法隨機性強，工作量大，很難重復(fù)獲得預(yù)期效果，因此，有必要提供一種通過定向的基因改造得到產(chǎn)去甲萬古霉素的菌株。

而本發(fā)明的申請人在申請?zhí)枮?00710036861.5的中國發(fā)明專利申請中，公開了萬古霉素生物合成基因簇中的26個基因。根據(jù)基因序列比對所得到的信息，其中的vcm12基因編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶，該酶是萬古霉素生物合成途徑中的一個重要的后修飾酶，它主要負責(zé)催化甲基轉(zhuǎn)移到萬古霉素七肽骨架的第一個氨基酸亮氨酸的N端氮原子上。

雖然根據(jù)基因序列比對得到的信息，vcm12基因編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶，但不能確定在敲除vcm12基因后是否表達得到去甲萬古霉素，例如，在Balhimycin的生物合成基因簇中，根據(jù)基因序列比對，就發(fā)現(xiàn)有兩個與鹵化作用相關(guān)的鹵化酶基因，bhaA(FADH₂-dependent?halogenase)和bhp(haloperoxidase/perhydrolase)，Oliver?Puk等在2002年通過基因敲除的方法發(fā)現(xiàn)bhaA被敲除后的菌株可產(chǎn)生無氯Balhimycin，而bhp被敲除后的菌株則不產(chǎn)生Balhimycin。因此，在敲除vcm12基因是否能獲得萬古霉素的衍生物，以及所獲得的萬古霉素的衍生物是否為所預(yù)想的去甲萬古霉素，則無法確定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種產(chǎn)去甲萬古霉素的方法。

本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法。

本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌。

本發(fā)明提供的生產(chǎn)去甲萬古霉素的方法，包括以下步驟：

(i)阻斷產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因，構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌；

(ii)發(fā)酵產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，以生產(chǎn)去甲萬古霉素。

本發(fā)明提供的構(gòu)建產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌的方法，包括以下步驟：

A)構(gòu)建重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒包含基因vcm12的左側(cè)同源臂-抗性基因-基因vcm12的右側(cè)同源臂片段，其中，基因vcm12為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因；

B)將步驟A中獲得的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化東方擬無枝酸菌，獲得阻斷突變株基因工程菌。

本發(fā)明提供的基因工程菌是基因vcm12被阻斷的東方擬無枝酸菌，其中，基因vcm12為產(chǎn)萬古霉素的東方擬無枝酸菌中編碼N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因。

本發(fā)明提供了一種產(chǎn)去甲萬古霉素方法，以及一種產(chǎn)去甲萬古霉素的基因工程菌，所述基因工程菌可用于發(fā)酵生產(chǎn)去甲萬古霉素。同時，本發(fā)明提供的基因工程菌是通過定向的基因改造得到的，所以能夠重復(fù)獲得，同時，也有利于對該菌株的進一步改造。

附圖說明

圖1是萬古霉素及去甲萬古霉素結(jié)構(gòu)圖，其中，當(dāng)R為CH₃時，該化合物為萬古霉素，當(dāng)R為H時，該化合物為去甲萬古霉素。

圖2是阻斷突變株Amycolatopsis?orientalis?dNMT的鑒定結(jié)果，其中，泳道1為以PND1和PND2為引物對的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；泳道2為PNE1和PNE2為引物對的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。

圖3是Amycolatopsis?orientalis?dNMT及其出發(fā)菌株的發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析圖譜，其中，圖(1)是萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜；圖(2)是東方擬無枝酸菌ATCC?43491發(fā)酵液上清的HPLC分析圖譜；圖(3)是去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖譜；圖(4)是阻斷突變株Amycolatopsis?orientalis?dNMT發(fā)酵液上清的HPLC分析圖譜。

圖4是去甲萬古霉素的質(zhì)譜圖。

圖5去甲萬古霉素的NMR圖譜，其中，圖5a去甲萬古霉素的H¹NMR圖譜，圖5b去甲萬古霉素的C¹³NMR圖譜。

具體實施方式