[發明專利]一種丹參乙酰CoA酰基轉移酶(SmAACT)基因的分析及應用

無效

• 申請號: 200910148599.2
• 申請日: 2009-06-30
• 公開（公告）號: CN101613704A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 黃璐琦;張夏楠;崔光紅;王學勇;戴住波
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/10;C12N15/63;C12N5/10;C12Q1/68;C12N15/84
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技術領域

本發明屬于藥用植物基因工程領域，具體地說，涉及利用cDNA芯片技術克隆一種新的丹參乙酰CoA酰基轉移酶(acetyl-CoA?acyltryansferase，AACT)基因，轉化該基因以提高丹參中二萜類次生代謝產物含量的方法。

背景技術

藥用植物有效成分(次生代謝產物)的形成是植物次生代謝途徑中特有基因的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將破解藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制，為藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。

二萜類化合物是植物中重要的次生代謝產物之一，在藥用植物中很多活性成分如紫杉醇、丹參酮IIA、雷公藤甲、乙素等均為二萜類化合物。藥用植物丹參Salvia?miltiorrhiza?Bge.為一味常用中藥，素有“一味丹參，功同四物”的美稱，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，是眾多復方、保健品的主要成分。丹參主要含有兩類活性成分：脂溶性的二萜醌類化合物和水溶性的酚酸類化合物。

萜類生物合成由甲羥戊酸途徑(MVA)和丙酮酸途徑(DXP)組成。MVA途徑長期以來都被認為是萜類化合物生物合成的惟一途徑。它由Conrad?Bloch和Feodor?Lynen于1958年首先在動物和酵母中發現，主要存在于細胞質中，又可稱為細胞質途徑(cytosolic?pathway)，通過該途徑形成了植物中的倍半萜、三萜和甾醇等。乙酰CoA酰基轉移酶(AACT)催化MVA途徑上第一個酶促反應，使2個分子的乙酰CoA縮合為乙酰乙酰CoA。迄今為止，已從擬南芥(Arabodipsisth?aliana)、橡膠樹(pararu?bbertree)、水稻(rice)和胡蘿卜(radish)中克隆并鑒定了AACT基因的全長cDNA。AACT在不同植物基因組中其拷貝數不同，在擬南芥中AACT有一個小的基因家族，而在胡蘿卜中，AACT是一個單拷貝基因，其表達受到光的調節。本發明首次從鼠尾草屬藥用植物丹參中克隆得到編碼SmAACT的基因，在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的丹參乙酰CoA酰基轉移酶基因及其氨基酸序列。

植物基因克隆的方法有很多種，如功能克隆、表型克隆、定位克隆等。近年來，國外研究者采用經典的功能克隆法克隆到一些藥用植物的關鍵酶基因，如紫杉醇合酶。然而在事先無目的蛋白或其相應基因定位的的情況下分離相關基因是相當困難的。因此，對于遺傳背景不清，相關基因產物不明的情況下，表型克隆成為基因克隆的主要方法。基因芯片技術是20世紀80年代發展起來的一項高新技術，它可以對生物整個基因組的所有基因表達同時進行實時監測，作為一個全新的、強有力的技術平臺，已廣泛地應用于功能基因組的研究中，也成為挖掘新基因的強有力手段。cDNA芯片已在擬南芥、水稻、番茄、棉花等多個植物中得到了應用，但在藥用植物功能基因研究中還沒有相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種丹參cDNA芯片的制作、雜交、差異基因分析以及功能基因克隆的方法，并通過過表達AACT基因，預測SmAACT基因在丹參萜類成分積累過程中的重要作用。本發明涉及的丹參cDNA芯片克隆關鍵酶基因、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、丹參酮類成分提取及含量測定方法用于本發明，為利用轉基因丹參大規模生產有效成分奠定了堅實的基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的：本發明應用cDNA基因芯片方法從丹參中克隆AACT基因；檢測茉莉酸甲酯處理后SmAACT基因的表達情況及丹參酮IIA含量的變化情況；構建含所述DNA分子的植物過表達載體，用根癌農桿菌介導，將AACT基因導入丹參并再生出植株；PCR檢測外源目的基因AACT的整合情況；HPLC測定丹參中四種萜類成分含量，篩選獲得萜類成分含量顯著提高的轉基因丹參植株。

本發明包括如下具體步驟：

(1)采用cDNA芯片方法獲得丹參乙酰CoA酰基轉移酶(SmAACT)基因；

(2)茉莉酸甲酯處理后SmAACT基因的表達情況及丹參酮IIA含量的變化情況；

(3)構建含AACT基因的植物過表達載體，轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化丹參的含AACT基因的根癌農桿菌菌株；

(4)利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化丹參，獲得經PCR檢測的轉基因丹參植株；

(5)對獲得的轉基因丹參中萜類成分含量進行HPLC測定，篩選獲得萜類成分含量顯著提高的轉基因丹參植株。