[發明專利]一種可溶表達的流感病毒血凝素HA2融合蛋白

無效

• 申請號: 200910147657.X
• 申請日: 2009-06-11
• 公開（公告）號: CN101921339A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 謝良志;孫春昀;張延靜
• 申請（專利權）人: 北京義翹神州生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12P21/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說，本發明涉及一種流感病毒的血凝素HA2片段的蛋白表達方法，該表達方法可在真核細胞如HEK-293系統中獲得可溶性的表達。

背景技術

流感是由流感病毒引起的可致人感冒，發燒，咽喉腫痛，咳嗽的一種病癥。其中最具有高致命性的是禽流感的H5和H7亞型。從流感康復病人身上獲得的抗血清一直是流感病人的一種重要的治療方式。但由于流感的類型多，每年的變異又很大，抗血清對新的突變株的結合效果很差，這使得流感的針對性治療無法有效進行。對流感康復病人的抗血清分析發現，絕大部分的抗血清主要針對血凝素蛋白(hemagglutinin，簡稱HA)。凝集素蛋白是流感病毒的受體結合和膜融合糖蛋白，也是感染-中和抗體的結合靶標【Laver?WG等，Virology?1976，69(2)：511-522】。它使得病毒與宿主細胞表面含唾液酸(sialic?acid)的受體貼附，并發生低pH誘導的構象轉變，引發病毒外殼與內體膜融合。該構象轉變的過程為蛋白酶將血凝素的前體蛋白HA0切割為兩個二硫鍵連接的HA1和HA2蛋白(lazarowitz.S.等，1975，Virology，68：440-454)。HA2亞基的N端有一段高度疏水的區域，該區域在不同類型的流感病毒株中都高度保守，并且參與病毒與宿主受體細胞膜的融合活性(Lamb.R.A等，1983，Springer-Verlag，Berlin.21-69)。該區域發生突變，病毒的融合活性會喪失或很大程度降低(Mary-Jane.G.等，TheJournal?of?Cell?Biology，1986，102：11-23)。

近來有實驗室用康復病人的血液的B細胞建立了抗體文庫，通過大量的篩選找到了針對HA2區域的較廣譜的中和抗體【Damian?C.E.等，Science2009，324(5924)，246-251；Tkacova，M.等，1997，J?Clin?Microbiol?35，1196-1198】，這些抗體可與HA2的融合肽或其附近結合，抑制HA與細胞膜的融合功能【E.Varekov等，2003，Arch?Virol?148，469-486】。這個重要的發現使獲得廣譜的中和抗體成為了可能。因此科學家都將目光投入到針對HA2融合肽的抗體研究和具有交叉保護的抗流感病毒的疫苗研究工作中。

HA蛋白為三聚體結構，分析其晶體結構發現其表面裸露的大部分蛋白都為HA1的部分，而HA2蛋白由于其所含的疏水性蛋白較多，它位于蛋白的內部。HA1蛋白在季節性流感和禽流感等流感亞型病毒中的變異較大，但HA2蛋白卻相對保守。

亞單位疫苗血凝素蛋白(hemagglutinin，簡稱HA)是一個很有吸引力的流感病毒滅活疫苗的替代品，HA蛋白疫苗的制備過程比滅活疫苗更安全，簡單【Treanor?JJ等，Vaccine，2001，19(13-14)：1732-17370】，它不會產生針對流感病毒內部蛋白的抗體，這可用于區分接種和受感染的禽類。由于其保守性和功能性，HA2蛋白亞單位流感疫苗的一個很好的選擇有可能使人體產生具有廣譜和交叉保護的中和抗體，從而避免經典流感滅活疫苗每年需要接種的不利因素，更重要的是，可以使接種人群對未來不可預測的突發性新型流感病毒感染具有免疫保護抗體。HA2蛋白還可以用于免疫動物或用于從全人抗體庫中篩選獲得針對HA2保守區域的具有交叉保護作用的治療性中和抗體。

重組蛋白可以在多個真核細胞表達體系中進行表達生產，也可以采用微生物表達體系進行表達生產。對于結構比較簡單，蛋白翻譯后修飾很少或翻譯后修飾對蛋白結構和活性沒有影響的蛋白，可以直接采用微生物表達體系，如大腸桿菌表達體系進行表達生產。對于結構相對比較復雜，蛋白翻譯后修飾很重要的蛋白通常很難采用微生物表達體系獲得，而需要采用真核細胞表達系統進行表達生產。真核細胞表達體系包括哺乳動物細胞，酵母細胞，和昆蟲細胞/桿狀病毒表達體系。

常用的哺乳動物細胞表達體系包括瞬時表達體系和穩定表達體系，瞬時表達體系可以采用人HEK293細胞，或中國倉鼠卵巢細胞(CHO)等，其主要方法是將大量的表達載體DNA質粒通過轉染試劑進入細胞內進行短時間內的蛋白表達，大部分DNA質粒并未整合到細胞的染色體上，因而不能實現長期的穩定表達。穩定表達體系是通過篩選DNA質粒整合到細胞染色體上的穩定表達克隆并建立穩定表達細胞株進行培養表達。常用的穩定表達宿主細胞系有人HEK293細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，BHK細胞，SP2/0細胞等。