[發明專利]用于鑒別診斷不同牛泰勒蟲的試劑盒及方法

有效

• 申請號: 200910146132.4
• 申請日: 2009-06-10
• 公開（公告）號: CN101570796A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 羅建勛;殷宏;劉軍龍;關貴全;李有全;劉志杰;劉愛紅;馬米玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司
• 代理人: 張 晉

技術領域

本發明涉及一種可鑒別診斷牛環形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲的試 劑盒，及這種試劑盒的制備和使用方法。

背景技術

牛泰勒蟲病是牛的蜱傳性疾病，感染牛的泰勒蟲有6種，其中致病性最強和引 起嚴重經濟問題的有兩種，一種是小泰勒蟲，另一種是環形泰勒蟲。在中國境內存 在的牛泰勒蟲主要有環形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲，水牛泰勒蟲/東方泰勒蟲和中華 泰勒蟲。中華泰勒蟲是白啟等發現的一種由青海血蜱傳播的新的牛泰勒蟲種， 主要分布在中國的甘肅和青海省。牛泰勒蟲的主要傳播媒介牛蜱廣泛存在于熱 帶和亞熱帶國家，鑒于本類疾病的嚴重危害，國際獸醫局(OIE)國際委員會于 1985年通過議案，建議各成員國加強蜱傳性血液原蟲病的協作研究，建立國際 性防制措施，以減少經濟損失。我國是世界上泰勒蟲病流行最嚴重的國家之一， 在該病的防治方面仍有大量工作要做。

隨著科學技術的不斷更新，牛泰勒蟲病檢測技術也有了迅速的發展。現在應 用最廣泛的是國際貿易組織指定的間接免疫熒光(IFA)試驗(陸生動物診斷試 驗和疫苗手冊)。IFA試驗敏感性好，并具有較強特異性，一般容易操作。但是， 由于一些泰勒蟲種間的交叉反映問題，在多種泰勒蟲感染的地區進行大規模普 查時，它的應用受到限制。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的血清學試驗正日益廣 泛的用于檢測寄生蟲特異性抗體，但是該方法只能單獨的檢驗某種特定得蟲種， 主要因各種檢測泰勒蟲抗體的ELISA存在特異性差，同時ELISA作為一種血清 學檢測方法，有時只能說明被檢動物是否感染過病原。

發明內容

本發明提供一種可克服現有技術不足，用于鑒別檢測牛環形泰勒蟲、瑟氏 泰勒蟲和中華泰勒蟲的試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。

本發明的試劑盒內至少包括有：環形泰勒蟲上游引物和環形泰勒蟲下游引 物、瑟氏泰勒蟲上游引物和瑟氏泰勒蟲下游引物，以及中華泰勒蟲上游引物和 中華泰勒蟲下游引物。

本發明的試劑盒內的各引物分別為：

a.環形泰勒蟲上游引物：

AnS?5’一GAGTTCAAGGACTAGAACC-3’

b.環形泰勒蟲下游引物：

AnR?5’-GAGTCTACTGGACATTGAAG-3’

c.瑟氏泰勒蟲上游引物：

SerS?5’-TGAATGCCTGCTCTACG-3’

d.瑟氏泰勒蟲下游引物：

SerR?5’-GCACACAGACACGAGTT-3’

e.中華泰勒蟲上游引物：

SinS?5’-AGTGTCGTCGAAGCGG-3’

f.中華泰勒蟲下游引物：

SinR?5’-GCACACAGACACGAGTT-3’

本發明實際上是一種多重PCR檢測方法，以及這種檢測方法的具體操作步 驟。聚合酶鏈式反應(PCR)技術現在可將微量的寄生蟲DNA放大一百萬倍， 本發明中根據轉錄間隔區核苷酸片斷設計的針對三種泰勒蟲的特異性引物使本 檢測方法具有非常好的鑒別診斷性，能夠準確的鑒定區分環形泰勒蟲、瑟氏泰 勒蟲和中華泰勒蟲的感染情況。根據泰勒蟲傳播媒介的固定性，檢測結果同時 能夠反映該地區媒介蜱的分布情況。由于本發明方法檢測的是寄生蟲DNA，所 以能夠實時反應動物感染寄生蟲的情況。

附圖說明

圖1為本發明擴增的環形泰勒蟲，瑟氏泰勒蟲和中華泰勒蟲基因片段電泳 圖。該結果證明在同一反應體中，本方法能夠同時檢測到三種泰勒蟲基因組的 存在情況。本圖中：M為DNA?Marker?DL2000；1為牛環形泰勒蟲，2為瑟氏 泰勒蟲，3為中華泰勒蟲混合基因組樣品。

圖2為牛環形泰勒蟲引物AnS/AnR特異性檢測的電泳圖，其中：M為DNA Marker?DL2000；1為環形泰勒蟲DNA；2為瑟氏泰勒蟲DNA；3為中華泰勒 蟲DNA；4為牛巴貝斯蟲DNA；5為雙芽巴貝斯蟲DNA；6為大巴貝斯蟲DNA； 7為卵形巴貝斯蟲DNA；8：巴貝斯蟲未定種DNA；9：陰性牛DNA。