[發明專利]一種在非接觸條件下培養誘導成體骨髓間充質干細胞轉變為汗腺細胞的方法

無效

• 申請號: 200910146087.2
• 申請日: 2009-06-08
• 公開（公告）號: CN101906401A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 付小兵;孫同柱;蔡颯;張翠萍
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/08
• 分類號: C12N5/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及人體汗腺再生研究領域。具體說來，本發明涉及一種在非接觸條件下，利用經過熱休克汗腺的條件培養基誘導成體骨髓間充質干細胞轉分化為汗腺細胞的方法。

背景技術

皮膚被覆于身體表面，是人體最大的器官。排汗功能是其眾多功能之一，可排出機體25％的熱量以保持體溫的相對恒定。輕度燒傷時汗腺細胞可以其深部未受創的部分為模板而完全修復，但全層大面積燒傷患者因汗腺被毀或被瘢痕組織堵隔而喪失了分泌汗液的功能，這不僅給患者的生理與心理帶來嚴重障礙，而且對其后期的生活與工作質量將產生嚴重影響。因此，研究皮膚損傷后汗腺組織的修復與再生，不僅是創(燒、戰)傷治療本身的需要，而且也是重塑人體生理與心理的需要，值得人們關注。

近年來，隨著干細胞生物學與再生醫學研究的深入，利用成體干細胞及其可塑性為皮膚附屬器的再生帶來了新的希望。就采用成體干細胞再生皮膚汗腺的策略而言，有以下幾個方面可以考慮：一是利用自身皮膚表皮干細胞直接誘導分化為汗腺細胞來再生汗腺。但問題的關鍵是在大面積嚴重創傷燒傷時由于皮膚的損毀，自體表皮干細胞的來源缺乏，因而從誘導殘存的表皮干細胞來直接再生汗腺的技術和方法將來在臨床應用會受到很大的限制。二是脂肪干細胞在一定條件下經誘導也具有分化為表皮細胞，進而再經誘導分化形成汗腺細胞的潛能。但由于這一條技術路線難度比較大，影響因素眾多，加之在大面積嚴重創傷燒傷時脂肪組織和皮膚組織一樣會受到嚴重的破壞，因而利用脂肪干細胞來重建汗腺也是一條艱難的途徑。為此，利用骨髓間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells，MSCs)來再生汗腺便成為一條重要的選擇。這條路線的主要優點包括：一是MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潛能；二是MSCs存在于骨髓基質，在大面積創傷、燒傷時受到外界的直接破壞作用比較小；三是儲存量比較大，在嚴重創傷和燒傷條件下能夠發生動員，容易獲取。基于以上原因，深入開展MSCs的分化調控研究對皮膚汗腺再生策略具有重要的理論意義和應用價值。

我們和他人大量的前期研究已經初步證明MSCs直接參與了皮膚損傷修復與再生的全過程，其中包括：皮膚組織損傷后，造血干細胞和間充質干細胞從骨髓動員到循環細胞池，并遷移到損傷部位。在早期炎癥階段，這些細胞調節上皮細胞和真皮間充質細胞的增殖和遷移，促進炎癥細胞趨化，參與創傷修復過程；炎癥消退后，骨髓來源的細胞可以分化為表皮細胞、皮脂腺細胞、毛囊上皮細胞、樹突狀細胞以及內皮祖細胞等，并且可以整合到愈合的皮膚，分化為CD45+的抗原呈遞纖維母細胞亞群；上皮化完成后，造血干細胞和MSCs都能長期重構愈合的真皮，產生I和III型膠原。在此基礎上，我們實驗室又進一步開展了MSCs向汗腺細胞誘導分化的研究，并在以下幾方面獲得了突破：1)通過MSCs與熱休克汗腺直接共培養技術，已成功將MSCs誘導成為汗腺細胞或汗腺細胞樣細胞，即經直接共培養誘導來的汗腺細胞具有正常汗腺細胞的形態、表型和功能特性；2)初步闡明在MSCs轉分化為汗腺細胞的過程中涉及的信號通路主要有NF-κB和ERK的激活；3)將上述誘導來的汗腺細胞樣細胞移植于裸鼠創面后，能顯著促進受損汗腺的修復與再生，即創面愈合后能正常發汗，組織形態學觀察證實創傷處有汗腺組織的再生；4)進一步的人體種植試驗表明，在切除瘢痕的創面種植經誘導后具有汗腺細胞表型的自體MSCs，不僅可以使這些移植的細胞存活，而且這些細胞還能轉變為汗腺組織并發揮排汗功能。形態學觀察顯示創部真皮淺層有大量CEA陽性細胞，結構類似正常汗腺組織。同時功能學檢測也表明再生的汗腺組織所分泌的汗液具有與正常汗液類似的pH值、滲透壓和化學組分。上述初步的實驗結果證明：1)通過建立適當的MSCs體外誘導方法，可以成功實現將MSCs誘導轉變為汗腺樣細胞；2)從臨床應用角度來講，通過非接觸的方法共培養誘導MSCs轉變為汗腺樣細胞可能會更安全、更實用。

發明內容

因此，本發明提供了一種在非接觸培養條件下，利用經過熱休克的汗腺培養基，誘導MSCs轉分化為汗腺細胞的方法，包括以下步驟：

a)分離并培養MSCs，用免疫細胞化學法鑒定其表面標志性蛋白CD29、CD44和CD105；

b)分離并培養汗腺細胞，用免疫細胞化學法鑒定其表面標志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19；

c)將上述培養的汗腺細胞進行熱休克處理，之后去除汗腺細胞，使之形成熱休克汗腺的條件培養基；

d)使用上述熱休克汗腺的條件培養基誘導MSCs向汗腺細胞的轉分化；