[發(fā)明專利]一種調(diào)控表達丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的構建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910145246.7
• 申請日: 2009-05-23
• 公開（公告）號: CN101671694A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發(fā)明（設計）人: 尹文;趙亞;孫夢寧;呂欣;雷迎峰;楊敬;康健;姚敏;薛采芳
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;C12N9/50;C12Q1/37;C12R1/93
• 代理公司: 西安慈源有限責任專利事務所
• 代理人: 鮑燕平

技術領域

本發(fā)明涉及一種調(diào)控表達蛋白酶的構建方法，尤其是調(diào)控表達丙型肝炎病毒 NS3/NS4A蛋白酶的構建方法及其應用。

背景技術

丙型肝炎病毒是引起慢性肝病的主要病原體，嚴重危害人類健康，已成為全球性的、 重要的公共衛(wèi)生問題，迄今，尚缺乏有效的抗病毒治療措施及有效的疫苗。

目前HCV最有效的治療僅僅是干擾素和利巴韋林聯(lián)合使用，效果在不同基因型之間 有很大差異，療效低于40％，而且副作用非常大。隨著臨床上蛋白酶和逆轉錄酶抑制 劑在治療HIV中的應用及取得的良好療效，近年來以在病毒基因組復制和多聚蛋白前體 加工成熟中起著關鍵作用的酶類(如絲氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA聚合酶)為靶點，尋 找特異有效的治療藥物已經(jīng)成為HCV防治研究的重要方向。

HCV?NS3蛋白的編碼基因全長共1893個核苷酸，位于基因組序列的nt?3420～5312 位點，編碼631個氨基酸的NS3蛋白。NS3蛋白近N端1/3(aa?1～180)具有絲氨酸蛋 白酶活性，近C端2/3具有三磷酸核苷酶(NTPase)和解旋酶(Helicase)活性。NS3蛋白 發(fā)揮蛋白水解酶功能需與NS4A蛋白協(xié)同，將多聚蛋白前體的非結構蛋白切割成為成熟 蛋白。鑒于HCV?NS3/NS4A蛋白具有多功能生物活性，在HCV基因組的復制與多聚蛋白 前體的加工成熟中有著重要的作用。還可以反式激活宿主細胞內(nèi)多種基因的表達，對肝 細胞的生長、代謝、甚至是惡性轉化產(chǎn)生重要影響，近年來，它已經(jīng)成為抗HCV感染研 究的主要靶位。而有研究表明HCV?NS3/NS4A蛋白酶抑制劑可明顯降低HCV的病毒水平， 因此建立表達丙型肝炎病毒HCV?NS3/NS4A蛋白酶的方法對篩選抗HCV藥物和研究 NS3/4A蛋白酶功能有重要意義。

長期以來，由于缺乏穩(wěn)定、可靠的動物模型，極大地制約著對HCV致病機制、搞病 毒藥物篩選和疫苗等研究的深入和發(fā)展。

目前，HCV動物模型的研究主要集中在感染動物模型、人-鼠肝臟嵌合小鼠模型和 轉基因小鼠模型三個方面。由于感染動物模型所采用的黑猩猩來源不便，及嵌合小鼠模 型操作難度大，成本高等原因，應用上存在很大的局限性。HCV轉基因小鼠是目前研究 應用最多且相對成熟的動物模型。

轉基因動物是指以實驗方法，把外源基因導入到動物體內(nèi)，這種外源基因與動物本 身的染色體整合，外源基因就能隨細胞的分裂而增殖，在體內(nèi)得到表達，并能傳給子代。 自1981年，第一次成功地將外源基因導入動物胚胎，創(chuàng)立了轉基因動物技術以來，轉 基因動物研究在許多領域都取得了令人矚目的成就，并在諸多領域具有廣闊的應用前 景。轉基因動物是對多種生命現(xiàn)象本質(zhì)深入了解的工具，并可以用來建立多種疾病的動 物模型，進而研究這些疾病的發(fā)病機理及治療方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種可調(diào)控型表達HCV蛋白酶的構建方法，所述轉基因小鼠的 基因組中含有編碼丙型肝炎病毒NS3/NS4A的轉基因DNA，并在所述目的基因HCV?NS3/ NS4A?DNA前加入調(diào)控基因序列及報告基因序列，能在調(diào)控因素存下表達活性的HCV?NS3/ NS4A蛋白酶。本發(fā)明還涉及所述轉基因動物的篩選及評價方法以及構建該可調(diào)控型表 達HCV蛋白酶轉基因小鼠模型在HCV致病機理研究和藥物的篩選與評價中的應用。

本發(fā)明的目的是通過下述方法實現(xiàn)的，調(diào)控表達丙型肝炎病毒NS3/NS4A蛋白酶的 構建方法，其特征在于：將運用雙重調(diào)控系統(tǒng)表達HCV?NS3/NS4A蛋白酶的真核表達載 體導入小鼠基因組，由此獲得的HCV?NS3/NS4A轉基因小鼠模型可用于與雙轉基因小 鼠的雜交，進而獲得三轉基因小鼠并用于HCV致病機理研究和藥物的篩選與評價。

所述轉基因動物的基因組中含有編碼丙型肝炎病毒NS3/NS4A的轉基因DNA，并在 所述目的基因HCV?NS3/NS4A?DNA前加入調(diào)控基因序列及報告基因序列，能在調(diào)控因素 存在下表達活性的NS3/NS4A蛋白酶。該蛋白酶是在肝臟內(nèi)特異性表達活性的HCV NS3/NS4A蛋白酶。

所述轉基因動物的基因組中含有螢光素酶報告基因和β-半乳糖苷酶報告基因； 能在啟動螢光素酶報告基因表達的同時，也能啟動β-半乳糖苷酶報告基因的表達， 雙報告基因的設計易于篩選。

所述構建調(diào)控序列包含LoxP位點、Luciferase和polyA序列，受Tet和Cre/LoxP 系統(tǒng)雙重調(diào)控表達。