[發明專利]宮頸癌的一種檢測方法

無效

• 申請號: 200910144476.1
• 申請日: 2009-08-11
• 公開（公告）號: CN101724684A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 方圣云;沈玉先;方輝;張協平;胡健力;王法財
• 申請（專利權）人: 合肥愛克森特生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/42
• 分類號: C12Q1/42;G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

研究背景

宮頸癌在女性惡性腫瘤中位列第二，僅次于乳腺癌，全球范圍內發病率占女性腫瘤總發病的12％，2000年全球約新增47萬女性患者，五年內累計有140萬女性被診斷患有宮頸癌，其中死亡的28.8萬患者中80％來自發展中國家。

分子和流行病學的研究表明絕大多數宮頸癌發病是由于暴露接觸高風險類型的人乳頭狀瘤病毒(HPV)所致，后者的基因型共有14種，其中HPV16型、18型是超過70％宮頸癌患者的致病原。

宮頸篩查目前被認為是控制宮頸癌發病的最有效手段，因為經濟發展狀況和收入水平的原因，不同國家和地區的篩查手段有所不同。在西方發達國家，多采用細胞學檢查，尤其是液基細胞學檢查和HPV病毒DNA檢測等方法；而在發展中國家和欠發達地區，則多采用宮頸涂片結合巴氏染色或乙酸染色法(VIA)來進行初步篩查。液基細胞學檢查和HPV病毒DNA檢測具有準確度和靈敏度均較高等特點，同時花費也高。宮頸涂片巴氏染色或VIA方法相對花費低廉，但同時也有靈敏度不高，假陰性高等不足。

發明概述

研究表明，宮頸癌細胞中酸性磷酸酶表達極為豐富，而在正常的宮頸細胞中其表達非常微弱，幾乎檢測不到。本發明正是基于此研究結果，在制備宮頸涂片基礎上，采用酸性磷酸酶染色法，即酸性磷酸酶水解磷酸萘酚AS-BI生成萘酚AS-BI與重氮化反應生成的重氮鹽與反應在細胞內生成深紅色沉淀，來鑒別癌變細胞。與傳統宮頸涂片檢查相比，該方法具有成本低，快速簡便，靈敏度高，假陰性率低等特點。該方法既適合于宮頸涂片，同樣適用于液基細胞質學檢查。

實驗方法

一、配制染色貯備液

1.堿性品紅溶液(4％)：堿性品紅，40克/升，溶于2摩爾/升鹽酸，4?℃避光保存

2.固醬紫溶液：Fast?GBC?base，7克/升，溶于0.4摩爾/升鹽酸，4℃避光保存????

3.萘酚AS-BI磷酸溶液：萘酚AS-BI磷酸，12.5克/升，溶于二甲基甲酰胺，4℃避光保存

4.亞硝酸鈉溶液：亞硝酸鈉40克/升，4℃保存

5.檸檬酸鹽緩沖液：檸檬酸，18毫摩爾/升，檸檬酸鈉，9毫摩爾/升，氯化鈉12毫摩爾/升，pH3.6，4℃保存

6.蘇木素染色液：蘇木素6.0克/升，碘化鈉，0.6克/升，硫酸鋁52.8克/升，常溫保存

7.醋酸鹽溶液：醋酸鹽溶液2.5摩爾/升，pH5.2，4℃保存

二、酸性磷酸酶染色步驟：

1)準備新鮮的固定液：25毫升檸檬酸鹽溶液，65毫升丙酮，8毫升37％甲醛；

2)準備充足的去離子水預熱到37℃；

3)固定液預先于室溫放置，涂片浸入固定液固定30秒后，用去離子水沖洗充分；

4)在管子中加0.5毫升堿性品紅溶液或固醬紫溶液和0.5毫升亞硝酸鈉溶液，輕微翻轉30秒混合，靜置2分鐘；

5)準備酸性磷酸酶染色

染色液預熱到37℃，避光

6)涂片放入染色液中，37℃水浴避光20-40分鐘；

7)去離子水中充分沖洗涂片，然后在蘇木素染色液中復染2-3分鐘；

8)用自來水沖洗涂片2-3分鐘；

風干，鏡檢。

說明書附圖

附圖1臨床確診宮頸癌患者宮頸涂片染色示意圖，箭頭所示紅色為酸性磷酸酶著色部位，圖中A所示細胞為酸性磷酸酶染色陰性細胞，B為陽性細胞，C和D為另一患者的酸性磷酸酶陽性細胞。

附圖2?E為健康對照宮頸涂片染色示意圖，無酸性磷酸酶陽性著色。F為宮頸癌細胞系Hela細胞染色示意圖，箭頭所示紅色為酸性磷酸酶著色部位，G為細胞放大2倍后效果。