[發(fā)明專利]麻瘋樹△9脂肪酸脫氫酶及其編碼基因、重組表達(dá)載體、宿主細(xì)胞與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910143931.6
• 申請日: 2009-06-03
• 公開（公告）號: CN101698849A
• 公開（公告）日: 2010-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李凝;王威
• 申請（專利權(quán)）人: 中華綠油有限公司
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/02;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12P7/64;C12R1/865
• 代理公司: 北京北新智誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11100
• 代理人: 趙郁軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及麻瘋樹(Jatrophacurcas)的Δ9脂肪酸脫氫酶及其編碼基因、重組載體與應(yīng)用。

背景技術(shù)

麻瘋樹(Jatropha?curcas)又名小桐子，為大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)，廣泛生長在亞洲、非洲和拉丁美洲等國家和地區(qū)。麻瘋樹是一種多用途的含油灌木植物，除作綠籬栽植外，其有效成分可以用于土壤和水資源防護(hù)、抗艾滋、殺菌劑生產(chǎn)、生物柴油、肥皂和蠟燭生產(chǎn)等。麻瘋樹的最大價值在于其種子油可以作為生物柴油。研究顯示麻瘋樹的種子含油量高達(dá)50～60％，每公頃產(chǎn)油可達(dá)2700公斤左右。因此，麻瘋樹也成為當(dāng)前生產(chǎn)生物柴油的最具開發(fā)價值和應(yīng)用前景的作物之一。印度、東南亞以及我國等多個國家和地區(qū)已經(jīng)將麻瘋樹生產(chǎn)生物柴油列為生物能源開發(fā)的重點(diǎn)領(lǐng)域。研究麻瘋樹的脂肪酸合成和調(diào)控基因，可為進(jìn)一步進(jìn)行基因工程改造、獲得高產(chǎn)油的優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)，具有重要意義。

油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)等不飽和脂肪酸是麻瘋樹種子油的主要組分，其含量分別占種子油總量的50％和30％左右。脂肪酸脫氫酶(脂肪酸去飽和酶)可以將脂肪酸鏈上的C-C單鍵轉(zhuǎn)化為C＝C雙鍵，產(chǎn)生不飽和脂肪酸。脂肪酸去飽和酶分為三類：酰基輔酶A去飽和酶(acyl-CoA?desaturase)、酰基-酰基載體蛋白去飽和酶(acyl-ACP?desaturase)和酰基脂肪去飽和酶(acyl-lipliddesaturase)(Murata?N，Wada?H，Biochem?J，1995.300：1-8)。在植物和藍(lán)綠藻中，大部分去飽和反應(yīng)由酰基脂肪去飽和酶完成，其將雙鍵引入到以酯形式存在的脂肪酸中。在植物細(xì)胞的質(zhì)體中存在酰基-酰基載體蛋白去飽和酶，可以將雙鍵引入到與酰基載體蛋白結(jié)合的脂肪酸中。在動物、酵母、霉菌中廣泛存在酰基輔酶A去飽和酶可將雙鍵引入到與CoA結(jié)合的脂肪酸中。目前只有植物的酰基-酰基載體蛋白去飽和酶是唯一可知的可溶性去飽和酶家族，它包括Δ9-硬脂酰ACP脫氫酶、Δ4-軟脂酰ACP脫氫酶、Δ6-軟脂酰ACP脫氫酶等。對脂肪酸ACP脫氫酶的晶體分析表明，此類酶可形成一個雙鐵活性中心，兩個鐵原子的結(jié)合高度對稱，其中1個鐵原子和E105和H146的側(cè)鏈作用；另一個與E105和H146的側(cè)鏈作用。在晶體結(jié)構(gòu)中，從酶表面到內(nèi)部有一個深的空穴，該空穴為脂肪酰的結(jié)合位(Caboon?E?B.，J?Boil?Chem，1994.269：27519-526)。硬脂酸(C18:0)去飽和產(chǎn)生油酸，一般認(rèn)為該反應(yīng)由Δ9-硬脂酰ACP脫氫酶在質(zhì)體的基質(zhì)中催化完成，然后以脂形式存在的油酸被轉(zhuǎn)運(yùn)到類囊體膜或進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)一步去飽和。研究表明，硬脂酸Δ9脂肪酸脫氫酶廣泛存在于油籽植物中，其表達(dá)受到生長環(huán)境中營養(yǎng)物和其他環(huán)境因素的影響(V.M.McDonough，J.E.Stukey，et?al.JBoil?Chem.1992.267：5931-5936)。由于Δ9脂肪酸脫氫酶是第一個向脂肪酸引入雙鍵的酶，其決定了生物體中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量比，在不飽和脂肪酸的合成中起了關(guān)鍵作用。目前，已有多種動物、植物、微生物等不同來源的脂肪酸脫氫酶基因的同源序列被分離獲得，并證明具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。研究Δ9脂肪酸脫氫酶的表達(dá)、生理功能和應(yīng)用是當(dāng)前的熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種編碼麻瘋樹Δ9脂肪酸脫氫酶及其編碼基因、重組載體、宿主細(xì)胞與應(yīng)用，以提高相應(yīng)不飽和脂肪酸產(chǎn)量。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種編碼麻瘋樹Δ9脂肪酸脫氫酶的基因，所述基因具有下列任意一種核苷酸序列：

a)SEQ?ID?NO.：1所示的核苷酸序列；

b)由于遺傳密碼的簡并性，不同于SEQ?ID?NO.：1但編碼的氨基酸序列與SEQ?ID?NO.：1所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

c)在嚴(yán)格雜交條件下與上述a)或b)中的核苷酸序列雜交，并且編碼具有活性的Δ9脂肪酸脫氫酶的核苷酸序列。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，上述編碼Δ9脂肪酸脫氫酶的基因具有SEQ?IDNO：1所示的核苷酸序列。

第二方面，本發(fā)明還提供一種麻瘋樹Δ9脂肪酸脫氫酶，其具有選自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列：

d)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列編碼的氨基酸序列；

e)SEQ?ID?NO.：2所示的氨基酸序列；