[發明專利]一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的制備方法

無效

• 申請號: 200910141974.0
• 申請日: 2009-06-12
• 公開（公告）號: CN101921798A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 張曼
• 申請（專利權）人: 張曼
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 王德楨

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的制備方法。

背景技術

臨床醫學的發展對檢驗結果的準確性、穩定性和敏感性要求越來越高，因此高質量的質控品、校準品和參考品是檢驗診斷中的關鍵產品。目前我國基本是應用第一代和第二代組織純化的鐵蛋白產品，其活性、線性、穩定性、特異性、敏感性、保存時間等均由于來源的不確定性而差異很大。因此，基因重組方法迅速應用并推動此類產品進入第三代。由于鐵蛋白結構復雜，24個亞基單位的共同復性極其困難，要獲得最小檢測限、高效價、大范圍線性要求的基因重組鐵蛋白標準品的技術性很高。因此，我國目前尚無基因重組鐵蛋白標準品。

由于鐵蛋白與炎癥病變、血液病、肝病、心腦血管疾病、腎病以及惡性腫瘤等密切相關，在這些疾病的臨床診斷、治療、監測中都起到重要的作用。因此，研究為保證檢驗質量研發不受來源的限制、性質穩定、批間差異小、使用成本較低的具有我國自主知識產權的基因重組鐵蛋白標準品迫在眉睫。特別是目前臨床上使用的鐵蛋白檢測方法多種多樣，各種方法之間的一致性難于比較。國內專家早已呼吁構建我國自己的鐵蛋白參考品，以期真正解決鐵蛋白測定的準確性和可比性。本研究設計了一種將鐵蛋白輕鏈(Ferritin?L)在大腸桿菌中表達的方法，經測序及Westernblot鑒定，證實具有良好的抗原性。現將結果報道如下。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的制備方法。為生產純度好、穩定、易儲存和運輸的鐵蛋白參考品建立基礎。

為解決上述技術問題，本發明所提供的技術方案是：

本發明提供一種基因重組人鐵蛋白輕鏈的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)采用RT-PCR技術從人血細胞中獲得人鐵蛋白輕鏈基因片段；

(2)將步驟(1)中PCR獲得的人鐵蛋白輕鏈基因片段亞克隆到pGEM-T載體上，轉化感受態Top10細菌，然后接種于含氨芐青霉素的LB培養基，篩選陽性克隆菌株，提取陽性克隆菌株的質粒pGEM-T/ferritin?L，并進行測序鑒定。

(3)以步驟(2)中的質粒pGEM-T/ferritin?L為模板，進行PCR擴增，然后對擴增產物進行雙酶切，同時將空質粒pET-30a進行雙酶切，分別回收并純化酶切產物，用T4連接酶連接，獲得表達載體，轉化感受態大腸桿菌，然后接種于含卡那霉素的LB培養基，篩選陽性克隆菌株，提取陽性克隆菌株的表達質粒pET-30a/ferritin?L，并進行測序鑒定。

(4)用IPTG誘導蛋白表達，純化鐵蛋白輕鏈。

其中，步驟(3)中所述大腸桿菌為BL21或DE3。

步驟(3)中所述雙酶切為用NdeI和BamHI進行雙酶切。

本發明具有的優點：目前，我國鐵蛋白國家標準品還是靠提純獲得。鐵蛋白參考品的研制，可以解決我國目前鐵蛋白參考品長期依靠進口的弊病，可以建立我國的標準物質，并為建立和完善鐵蛋白檢測的溯源體系打下基礎；為今后提高臨床鐵蛋白檢測的準確性、一致性和可靠性提供保證，同時為提高我國鐵蛋白測量值在國際上的可比性、等效性起到重要的作用。本發明是運用基因重組的方法，分別表達出鐵蛋白的輕鏈，并對所得到的蛋白進行初步分析鑒定，確定鐵蛋白基因重組參考品研發的可行性，并為臨床其它參考品的研發提供了新的思路。

附圖說明

圖1pET-30a/ferritin?L基因擴增產物電泳圖。(1DNA?marker；2pET-30a/ferritin?L?PCR產物)

圖2pET-30a/ferritin?L?SDS-PAGE電泳圖。(1蛋白marker；2pET-30a/ferritin?L表達產物)

具體實施方式

下面采用具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

菌種和質粒

感受態大腸桿菌Top10購自Tiangen公司；pGEM-T克隆載體試劑盒購自北京賽百盛公司；大腸桿菌BL21(DE3)菌株和表達載體pET-30a購自Novagen公司。

主要試劑

Taq?DNA聚合酶及引物購自北京賽百盛公司；質粒小量提取試劑盒、總RNA提取試劑盒以及RT-PCR試劑盒購自北京Tiangen公司；限制性內切酶購自NEB公司；和T4連接酶等工具酶購自北京賽百盛公司；DNA回收試劑盒購自Tiangen公司；鼠抗人Ferritin?L單克隆抗體購自Santa?cruz公司；HRP標記的羊抗鼠IgG購自賽馳生物；其它試劑均為國產或進口分析純。