[發明專利]一種檢測傳染病病原體的方法及便攜式檢測裝置

無效

• 申請號: 200910141622.5
• 申請日: 2009-05-14
• 公開（公告）號: CN101886118A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 于常海;劉樂庭;馮曉燕
• 申請（專利權）人: 北京海康基因芯片開發有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/70;G01N21/64;G01N21/82;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及分子生物學，特別是涉及檢測傳染病病原體的方法及便攜式檢測裝置。

背景技術

在傳染病流行的初期，準確、快速、便捷地對傳染病的病原體進行檢測，是控制傳染病流行的關鍵。雖然國內和國際上已經建立了傳染病的監測系統，但是現有的檢測手段各有局限性。

血清學檢查利用相應的抗體與抗原結合檢測到病原體，此方法診斷快速，簡單、易于操作，但必須制備出針對該病原體的抗體后才能夠進行檢測，尤其是在還沒有抗體來源的情況下不適用于傳染病的早期診斷。

病原體分離法是通過直接對病原體進行分離培養，檢測鑒定病原體。此方法靈敏度高、特異性強，但操作復雜、費時(至少要花費一周時間)，對實驗室生物安全條件要求非常高，所以很難在疫情發生現場采用，而且不是所有的病原體都能通過病原體分離法獲得。

核酸檢測技術操作簡便，反應快速，尤其是近年來發展的實時熒光定量PCR(Real?time?PCR)，靈敏度高，且能夠監控整個反應進程，但一直存在DNA污染造成的假陽性率高的問題，而且由于其臨界值不明顯，因此檢測結果灰區較寬，無法標準化，而且由于儀器要求高，投入大，對操作人員要求高，需要進行專業技能培訓，還限制了多重檢測的應用。同時該方法對于病原體含量極低的樣本仍然無法檢測。

NASBA(Nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA，依賴核酸序列的擴增技術)是一項連續、等溫、基于酶反應的核酸擴增技術。該技術的反應體系包括反轉錄酶、核糖核酸酶H、噬菌體T7核糖核酸聚合酶和兩條特別設計的寡核苷酸引物，其上游引物3′末端與模板的3′末端互補，5’末端含有噬菌體T7的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子序列.在擴增起始階段，上游引物與正義RNA模板結合后，在反轉錄酶的作用下合成與靶標RNA互補的反義cDNA，而原來的的RNA模板則被RnaseH降解。接著下游引物與cDNA雜交，在反轉錄酶的DNA聚合酶特性的作用下合成雙鏈cDNA，即對應靶標RNA的雙鏈cDNA拷貝。由于雙鏈cDNA一端包含有T7RNA?polymerase的啟動子序列，從而誘導了RNA聚合酶的活性，合成大量的與靶標序列互補的反義RNA鏈。如此循環反復，RNA拷貝數被不斷放大。

利用染料Gelred、EB、Calcein和MgCl2的特性檢測NASBA特異擴增產物。Gelred和EB作為核酸染料通過紫外激發觀察熒光，NASBA擴增過程中產生的大量焦磷酸鹽副產物與Calcein競爭結合Mn²⁺而發熒光，MgCl₂先直接和焦磷酸鹽作用產生絮狀沉淀.通過觀察熒光或沉淀來檢測NASBA擴增產物，判斷病毒模板的感染情況。以此來檢測此方法操作簡單，結果表現直觀，適用于樣品的快速檢測。

流感病毒A亞型主要通過呼吸道傳播，發病急，傳染快，致病性高并且難以與普通感冒區分，極易延誤診斷和治療的最佳時機。目前尚未見報道快速直觀能檢測及鑒別流感病毒A亞型傳染病病原體的檢測方法，也沒有相應的便攜式檢測裝置上市。其它可以應用此方法進行的傳染病病原體診斷還包括禽流感病毒H5亞型、禽流感病毒H7亞型、SARS冠狀病毒、漢坦病毒，耶氏鼠疫菌和炭疽桿菌等。

發明內容

本發明目的是克服現有技術不方便攜帶，不能直接觀察結果的缺陷，提供一種對可能存在于生物樣品中的傳染病病原體進行檢測的方法，所述傳染病病原體為流感病毒A亞型，包括：

(i)擴增生物樣品的核酸片段，所述核酸片段為流感病毒A亞型基質蛋白1基因如SEQ?ID?NO.1所示的核酸片段；

(ii)用染料Gelred、EB、Calcein、MgCl₂進行檢測.

本發明還提供步驟(i)使用的引物，其核苷酸序列如下所示：引物用于擴增如SEQ?ID?NO.1所示的核酸片段，其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；

本發明還提供所述步驟(ii)使用的染料，包括Gelred、EB、Calcein或MgCl₂的一種。

本發明所用儀器如迷你離心機、恒溫儀、酶標儀等都可使用普通電源、蓄電池或干電池作為整套裝置所需的能源。

上述方法的結果處理可以采取如下方案：測試K個陰性對照樣品和陽性樣品，比較它們的熒光是否出現或沉淀的多寡，出現熒光或出現渾濁即判斷為“陽性”。