[發(fā)明專(zhuān)利]編碼豬肺炎支原體P102蛋白的DNA及其制備方法和用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910140494.2
• 申請(qǐng)日: 2009-05-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101565707A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 辛九慶;李媛;陳超;郭丹;郭軍;曹培麗;張美晶;董慧;姜海芳;趙巧香;劉洋
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/31
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/31;C12P19/34;C12N15/63;C12N5/10;C07K14/30;C12Q1/68;G01N33/543;C12R1/35
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 孫皓晨;費(fèi)碧華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA，尤其涉及一種編碼豬肺炎支原體P102蛋白的DNA及其制備方法，本發(fā)明還涉及由該DNA所編碼的重組蛋白以及該重組蛋白在豬地方性支原體肺炎的血清學(xué)診斷中的用途，屬于豬肺炎支原體的診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬肺炎支原體(Mycoplasma?hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎(MPS)的主要病原體，該病又稱(chēng)豬地方流行性肺炎(EPP)，本病在我國(guó)流行范圍廣，對(duì)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。MPS以接觸性、高度傳染性、慢性、高發(fā)病率和低死亡率為特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難。解剖可見(jiàn)肺組織肉變或大理石樣病變。其主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降。

國(guó)內(nèi)外多年的研究成果表明，Mhp與豬呼吸道纖毛的特異性黏附是引起豬支原體肺炎發(fā)生的先決條件，而Mhp表面的黏著素(黏附因子)在Mhp致病中起關(guān)鍵作用。目前.已闡明的Mhp粘附因子共有3種，即P97(232株)、Mhp1(P5722株)和J株的一個(gè)分子量為94kDa的蛋白，其中研究最為深入的是P97蛋白。1995年張啟敬利用單克隆抗體F2G5抑制Mhp對(duì)豬呼吸道纖毛細(xì)胞的粘附作用，免疫印跡結(jié)果顯示F2G5主要識(shí)別一個(gè)約97kDa的蛋白(P97)。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)F2G5識(shí)別的蛋白質(zhì)隨機(jī)分布于Mhp的表面。這些結(jié)果顯示P97的功能是作為Mhp的粘附因子。在P97下游有一段與之相鄰的基因P102。由于它與P97相鄰且經(jīng)分析預(yù)測(cè)它也有細(xì)胞黏附或輔助P97的細(xì)胞黏附作用。

由于Mhp與豬鼻支原體(Mh)、豬絮狀支原體(Mf)等存在共同抗原，目前Mhp的ELISA等血清學(xué)診斷方法有交叉反應(yīng)。針對(duì)該病，人們一直在努力研究快速、方便、準(zhǔn)確的早期診斷方法，P97黏附因子是豬肺炎支原體的特異性外膜蛋白，Mhp感染時(shí)P97引發(fā)的免疫反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其它抗原蛋白所引發(fā)的免疫反應(yīng)，抗P97的IgA和IgM較針對(duì)其它抗原的抗體早出現(xiàn)35-60天，這對(duì)于Mhp的診斷與檢測(cè)方面具有重要意義。蘇銳等(豬肺炎支原體P97基因原核表達(dá)產(chǎn)物單抗的制備，中國(guó)人畜共患病雜志，2005，3)利用P97蛋白C端的R1區(qū)是其主要的抗原決定簇，以大腸桿菌表達(dá)的P97黏附因子R1融合蛋白作為免疫原免疫BALB/c鼠，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)平行篩選，獲得兩株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A₉-H₇、H₁₁-E₇。兩株細(xì)胞經(jīng)體外連續(xù)傳代1個(gè)月并凍存復(fù)蘇后均能分泌高效價(jià)的抗融合蛋白抗體，并能在小鼠體內(nèi)形成腫瘤，有效誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的腹水抗體，且均與天然Mhp168毒株顯示出較強(qiáng)的反應(yīng)特性，從而制備出了針對(duì)識(shí)別單一抗原決定簇的特異性單抗，為進(jìn)一步研究和建立Mhp快速、靈敏、準(zhǔn)確的診斷及檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。

李穎平等(豬肺炎支原體黏附因子P97基因抗原區(qū)的克隆與表達(dá)，豬業(yè)科學(xué)，2006.3)根據(jù)Genbank中豬肺炎支原體J株模式株(ATCC?25934或NCTC?10110)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出豬肺炎支原體168株P(guān)97基因序列的R1R2區(qū)序列，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，克隆入原核表達(dá)載體PET-32a(+)的EcoR?I和Xho?I位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，將篩選出的陽(yáng)性克隆用PTG誘導(dǎo)，從而使P97蛋白基因獲得了表達(dá)。這為豬肺炎支原體免疫檢測(cè)與診斷以及新型疫苗的研制提供了重要條件。此外Kim?T?J(Serodiagnostic?comparison?between?two?methods，ELISA?and?surface?plasmonresonance?for?the?detection?of?antibody?titres?of?Mycoplasma?hyopneumoniae.J?Vet?MedB?Infect?Dis?Vet?Public?Health.2006?Mar；53(2)：87-90.)利用P97蛋白中的分子量為30KDa的蛋白為抗原建立了檢測(cè)豬肺炎支原體抗體滴度的表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)ELISA方法具有正相關(guān)性，且具有很高的特異性和敏感性。