[發明專利]基于環介導等溫擴增技術的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 200910138327.4
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101565753A
• 公開（公告）日: 2009-10-28
• 發明（設計）人: 曹以誠;陳洵;李志勇;杜正平;譚慧媚;李心暉;王志強;高東微;鄧小玲;柯昌文
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/445
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種金黃色葡萄球菌基因快 速診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術

目前對金黃色葡萄球菌有多種檢測方法，從以病原微生物分離鑒 定、形態學鑒定和自動生化鑒定為主的國家標準(GB/T4789.7- 2003)，到特異蛋白的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應 (PCR)技術等分子生物學檢測方法[食品安全檢測與現代生物技術，化 學工業出版社，2004年]。其中病原核酸檢測在快速性、安全性、準 確性和靈敏性等方面都有很大的提高，這些新技術試圖突破傳統的形 態學、生化反應等微生物學檢測舊模式，不需要對微生物進行分離提 純，而直接用樣品或樣品的增菌液對其基因及基因產物進行快速檢 測，并且與分子生物學技術及生物信息學手段相結合，向準確、快速、 靈敏和自動化的方向發展。

以聚合酶鏈式反應(PCR)技術為代表的病原核酸檢測技術在實 際應用中也存在一些問題，如普通聚合酶鏈式反應(PCR)技術需要 專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點。而熒光 實時定量聚合酶鏈式反應(real?time?PCR)技術雖然較好地解決了交 叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復雜的定量測定儀器， 因此不適用于現場快速檢測。而且實時定量聚合酶鏈式反應PCR技術 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應用的難度。免疫學檢測技術快 速簡便成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確 性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時運用生物技術發展的最 新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中等 溫擴增(Isothermal?Amplification)核酸快速檢測技術是病原核酸檢測 技術上的長足進步，現已建立起來的環介導等溫擴增技術 (loop-mediated?isothermal?amplication?of?DNA，簡稱LAMP)具有很 多的優越性，且目前也未見有用環介導等溫擴增技術檢測金黃色葡萄 球菌的基因快速診斷試劑盒。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術存在的不足，提供一種檢測成本 低、使用方便、檢測速度快、特異性高的基于環介導等溫擴增技術的 金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒。

本發明的另一個目的是提供上述金黃色葡萄球菌基因快速診斷 試劑盒的檢測方法。

本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的：

一、本發明的金黃色葡萄球菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對引 物、Bst?DNA聚合酶、反應液、穩定液、樣品預處理液、顯色液和陽 性對照液組成，以上六種液體分別置于容器中，其中：

所述的兩對引物為：

外引物F3：TTTTCATAATCRATCACTGGAC，如SEQ?ID?NO：1 所示；

外引物B3：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT，如SEQ?ID?NO：2 所示；

內引物FIP：ACAAIAATAACGAGGTYATTGCAGCTTTTCTTG AACACTTTCATAACAGGTAC，如SEQ?ID?NO：3所示；

內引物BIP：CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTTTCAGA TAGCATGCCATACAGTC，如SEQ?ID?NO：4所示；

上述反應液含有1.6～2mmol/L?dNTP、20～25mmol/L?Tris-HCl、 10～12.5mmol/L氯化鉀、10～12.5mmol/L硫酸銨、8～10mmol/L硫 酸鎂、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜堿、內引物FIP/BI P各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L。優選的比例是 反應液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L?Tris-HCl、12.5mmol/L氯化鉀、 12.5mmol/L硫酸銨、10mmol/L硫酸鎂、0.125％TritonX-100、1mol/ L甜菜堿、內引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。 (0.1～0.125％TritonX-100是指：Triton?X-100占樣品預處理液的體積 百分比為0.1～0.125％)