[發明專利]一種利用熒光顯色定量檢測新生兒血中苯丙氨酸濃度的試劑盒

無效

• 申請號: 200910136686.6
• 申請日: 2009-05-13
• 公開（公告）號: CN101887060A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 王曉華
• 申請（專利權）人: 北京協和洛克生物技術研究開發中心
• 主分類號: G01N33/52
• 分類號: G01N33/52;G01N1/28;G01N1/34;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種定量檢測濾紙干血片中新生兒苯丙氨酸濃度的體外診斷試劑盒，其特征在于：所述試劑由琥珀酸緩沖液、二肽溶液、茚三酮溶液、銅溶液、萃取液、96孔微孔板(透明)、標準血片組成。

2.如權利要求1所述的苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述琥珀酸緩沖液配制方法：

(1)用分析天平準確稱取琥珀酸所需量，放入適量的燒杯中；

(2)加入配制總量的80％的雙蒸水進行溶解；

(3)調PH值至5.8±0.01，用雙蒸水進行定容；

(4)再用0.22um規格微孔濾膜對琥珀酸緩沖液進行過濾，將過濾好的琥珀酸緩沖液按照規定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放入2～8℃冰箱保存備用。

該權利中所述琥珀酸緩沖液配制時與國外試劑盒不同點在于，我們研制人員在保持該緩沖液無菌這個環節采用0.22um規格微孔濾膜在十萬級操作間內對琥珀酸緩沖液進行過濾，代替了以往使用的疊氮鈉防腐的方法。目的在于：1)對該試劑較長時間的保存。2)避免造成人體、環境的危害。3)避免了試劑在運輸過程危險隱患。

3.如權利要求2所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述二肽溶液包括L-亮氨酸、L-丙氨酸，其配制方法：

(1)用分析天平準確稱取L-亮氨酸、L-丙氨酸所需量，加入容量瓶；

(2)加入配制總量的雙蒸水80％的量進行溶解。待完全溶解后，最后用雙蒸水進行定容，獲得二肽溶液。將配制好的二肽溶液按照規定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放入2～8℃冰箱保存備用。

4.如權利要求3所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述茚三酮溶液，其配制方法為：

(1)用分析天平準確稱量茚三酮所需量；

(2)加入配制總量的雙蒸水80％的量進行溶解，待完全溶解后，最后用雙蒸水進行定容，獲得茚三酮溶液。將配制好的茚三溶液按照規定量分裝到試劑瓶內擰緊瓶蓋放入2～8℃冰箱保存備用。

5.如權利要求4所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述銅溶液包括碳酸鈉溶液、酒石酸加納溶液和硫酸銅溶液，其配制方法為：

(1)碳酸鈉溶液的配制：

用分析天平準確稱取碳酸鈉所需量，加入容量瓶，加80％量蒸餾水，完全溶解后，將配制好的溶液封裝好放入2～8℃冰箱保存備用。

(2)酒石酸加納溶液的配制：

用分析天平準確稱取酒石酸加納所需量，加入容量瓶，加80％量蒸餾水，完全溶解后，將配制好的溶液封裝好放入2～8℃冰箱保存備用；

(3)硫酸銅溶液的配制：

用分析天平準確稱取硫酸銅所需量，加入80％量蒸餾水，完全溶解后，將配制好的溶液封裝好放入2～8℃冰箱保存備用備用；

(4)銅溶液的配制：

將配好的三個備用溶液按順循序即硫酸銅倒入無水碳酸鈉，酒石酸鉀鈉兩種混合液中，磁力攪拌器不停攪拌，完全溶解后，用雙蒸水定容，將配制好的溶液按照規定量分裝到試劑瓶內，擰緊瓶蓋放在2～8℃冰箱保存備用。

6.如權利要求5所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述萃取液配制方法為：

1)用分析天平準確稱量配制總量的30％的三氯乙酸固體，放入適量燒杯內；

2)加入適量雙蒸水溶解后，進行定容；

3)將配制好的萃取液按照規定量分裝到試劑瓶內，擰死瓶蓋放在2～8℃冰箱保存備用。

該權利中所述萃取液配制時與國外試劑盒不同點在于，進口試劑盒所需的萃取液為高濃度的酒精揮發很強，實驗結果誤差很大。而我們研制人員使用的是三氯乙酸和雙蒸水結合配制出萃取液。目的在于：1)避免了由于試劑本身原因造成的結果誤差偏大。2)可以和其它配套試劑同樣保存，降低生產成本。

7.如權利要求6所述苯丙氨酸定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：所述標準血片、質控血片的的制備方法為：

(1)將全血用4-8層紗布過濾；

(2)然后離心3000轉20分鐘，棄取血漿；

(3)再用生理鹽水洗3次，3000轉離心20分鐘，棄取上清；

(4)最后一次離心4000轉30分鐘，用60g/L牛血清白蛋白調好比例，混勻測血球壓積為55-65％；

(5)將血球分成8份加入不同濃度的苯丙氨酸(A-F)標準和質控(C1-C2)用配制好的標準按照不同的濃度滴到903#濾紙上，自然陰干(2-4個小時)，放入裝有干燥劑的塑料袋里2-8度貯存備用。

苯丙氨酸測定：

1.實驗前將試劑盒先放在室溫(18℃～25℃)平衡，銅溶液仍放在2～8℃冰箱內，即取即用。

2.反應混合液：琥珀酸緩沖液、二肽溶液和茚三銅溶液按5∶1∶2比例混合，避光保存，4小時內用完；

3.用專用打孔器打下直徑3mm標準品、質控品、樣本的濾紙血斑，放入透明微孔板相應的孔中；

4.每孔加入80ul萃取液，蓋膜，室溫振蕩30分鐘(振蕩時避免血片上下跳動，以免萃取不完全)；

5.每孔取出萃取液50ul轉移到白色微孔板的相對應孔中；

6.每孔加入反應混合液50ul，蓋膜，振蕩15秒，60℃溫育1小時或37℃溫育2小時；

7.從溫育箱中取出微孔板，放入冰箱(-18～-20℃)冷凍3～5分鐘；

8.每孔加冷的銅溶液200ul(2～8℃冰箱內取出)，避光在室溫溫育15～30分鐘；

9.上機測定，熒光儀使用的激發波長390nm，發射波長486nm。