[發明專利]一種人RBPMS多肽及其抗體制備方法

有效

• 申請號: 200910136298.8
• 申請日: 2009-05-06
• 公開（公告）號: CN101880316A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 張虎生;石春林;茹莉莉;王敏;王越;薛沿寧;姜虹
• 申請（專利權）人: 北京奧維亞生物技術有限公司
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K16/18
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.技術領域

本發明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢測。

2.背景技術

1)RBPMS功能：RBPMS是RNA結合蛋白RRM家族的一個成員，RRM結構域長度為80-100氨基酸，家族成員包括1-4個拷貝的該結構域。RRM結構域包括兩個叫做RNP1和RNP2短的伸展的保守序列，和一些高度保守的疏水殘基。RBPMS在N末端有一個單一的，假想的RRM結構域。該蛋白廣泛表達，表達水平因蛋白亞型和組織而異。有研究標明，RNA結合蛋白在Smad介導的轉錄活性的調控中發揮作用，RBPMS有可能通過促進Smad2和Smad3在C末端磷酸化以及Smad蛋白的核累積來刺激Smad介導的轉錄激活(Nucleic?Acids?Res.2006；34(21)：6314-26.Epub2006?Nov?11)。該蛋白在非洲爪蟾(Xenopus)中的同源蛋白hermes的序列和表達模式表明，hermes參與了心臟發育過程中轉錄后調控(Mech?Dev.1999?Jan；80(1)：77-86)。

2)RBPMS抗體產品信息：經檢索，除我公司產品外，市場上沒有其他Anti-RBPMS多克隆抗體。

3)RBPMS抗體的應用：

一個用陣列比較基因組雜交(Array?comparative?genomic?hybridization)的研究發現，在去分化肝癌和13號染色體長臂(13q)缺失的肝癌中，RBPMS基因顯著上調，肝癌的去分化與參與細胞周期調控和增值的一些基因的上調有關(Mod?Pathol.2008?Dec；21(12)：1479-89.Epub?2008?Sep?26)。這就提示我們，該靶蛋白有可能在不久的將來成為一個潛在的具有基礎研究和臨床應用價值的腫瘤標志物。

3.發明內容

本發明提供了一種RBPMS多肽，其序列為：DSRSEAEAAKNALN。用此多肽制備的抗RBPMS抗體可以在免疫印跡(Western?blot)及免疫組化(IHC)分析中特異識別組織或細胞中的天然RBPMS蛋白。

抗RBPMS抗體是通過以下步驟獲得的：

步驟一：多肽序列的分析和設計：利用DNAstar軟件對RBPMS蛋白的氨基酸序列進行抗原表位分析，主要評估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區等指數，再結合過去制備抗體的實際經驗，最終確定RBPMS蛋白69-82位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為DSRSEAEAAKNALN。

步驟二：多肽合成和交聯：采用ACT396全自動多通道多肽合成儀合成目的多肽，并采用質譜進行鑒定；為增強多肽的抗原性，將RBPMS多肽與載體蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交聯法進行交聯。

步驟三：多肽免疫和抗血清制備：將交聯后的RBPMS-KLH與弗氏佐劑混合乳化，在新西蘭兔背部進行皮內注射免疫，并反復加強免疫，至取血檢測抗體效價達到標準時停止免疫。

步驟四：抗體純化：實驗兔抗體效價達到標準后，采用心臟取血，分離抗血清，采用Protein?A純化全抗體后，進一步采用肽親和純化，得到目標抗體。

抗RBPMS抗體是通過以下步驟鑒定的：

步驟一：免疫印跡：將所獲得的RBPMS抗體作為一抗，采用標準的免疫印跡方法，確認該抗體能夠與變性后的天然RBPMS蛋白相互作用，可用于免疫印跡試驗。

步驟二：免疫組化：將所獲得的RBPMS抗體作為一抗，采用標準的免疫組化方法，用于檢測組織芯片(9種組織胎兒組織)，確認該抗體能夠與具有天然結構的RBPMS蛋白相互作用，可用于免疫組化試驗。

4.附圖說明

圖1為免疫印跡圖(Western?blot)

圖2為免疫組化(IHC)圖

5.具體實施方式

1.多肽序列的分析和設計

利用DNAstar軟件對RBPMS蛋白的氨基酸序列進行抗原表位分析，主要評估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區等指數，再結合過去制備抗體的實際經驗，考慮氨基酸結構復雜程度，易氧化程度，合成難度，氨基酸類別和分布等，最終確定RBPMS蛋白69-82位14個氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為DSRSEAEAAKNALN。同時，為保證后期多肽交聯載體蛋白以及肽親和純化，在N末端增加一個半胱氨酸C，最終待合成多肽序列為DSRSEAEAAKNALN。