[發明專利]破傷風毒素受體結合區Hc在大腸桿菌中的高效表達及應用

有效

• 申請號: 200910135972.0
• 申請日: 2009-05-07
• 公開（公告）號: CN101880675A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發明（設計）人: 陳薇;于蕊;侯利華;于長明;劉樹玲;任軍;房婷
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/33;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/00;C12P21/02;A61K39/08;A61P31/04;C12R1/145
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技術領域：

本發明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一個破傷風毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白以及作為亞單位疫苗在破傷風預防方面的應用。

技術背景：

破傷風是一種嚴重危害人民生命健康的疾病，它是由革蘭氏陽性、厭氧的梭狀芽胞桿菌——破傷風桿菌侵入人體傷口、生長繁殖、產生破傷風毒素引起的一種急性特異性感染，破傷風毒素入侵神經系統可導致人全身性肌肉痙攣，進而全身性衰竭或窒息死亡。一切開放性損傷，均有發生破傷風的可能。破傷風毒素的毒性非常強烈，僅次于肉毒毒素，約100ng的破傷風毒素便可以致人死亡。破傷風在廣大貧困落后的第三世界國家和地區非常嚴重。據估計，世界上每年約有100萬病例發生，死亡率在50％左右。在發展中國家，新生兒破傷風死亡率高達90％。尋找高效、安全的破傷風預防和治療藥物是各國致力的方向。

破傷風毒素全長1315個氨基酸，分子量為150kD，共由A、B、C三部分組成，每部分分子量均為50kD。C片段是重鏈的C端，具有結合神經細胞的作用。B片段是重鏈的N端，具有導入作用。A片段是輕鏈，有蛋白酶活性，可抑制神經傳遞物質的釋放，具有麻痹作用。傳統的類毒素疫苗是破傷風毒素經甲醛脫毒、鋁佐劑吸附精制而成的，雖然其免疫效果較好，但仍存在一些問題：接種類毒素后有一定的副反應發生；破傷風梭菌可形成芽孢形式，毒性高，生產疫苗有一定危險性；甲醛處理類毒素容易造成污染；化學處理后的類毒素可能發生毒性逆轉；而且重要的是免疫期短，隨著年齡的增長，對破傷風免疫力下降，兒童需要4～6年加強免疫，成人需要每10年加強一次免疫。因此，現有的類毒素疫苗還需進一步改進和發展，而開發新型的基因工程疫苗是方向之一。實驗已證實用完整的毒素分子進行免疫并不是必需的。破傷風天然C片段(Hc)保留了完整毒素與神經節苷脂結合等許多性質，免疫效價與毒素相當，無毒性，過敏原性低，是將來發展亞單位疫苗和基因工程疫苗的候選者，已被用于研究亞單位疫苗、細菌和病毒載體疫苗、粘膜疫苗等很多方面。

用大腸桿菌表達抗破傷風毒素的亞單位疫苗具有重要的意義，其工藝簡單，重組的Hc蛋白不用擔心被完整毒素所污染，其安全性較高，但目前表達的破傷風Hc片段普遍存在表達量較低，易形成包涵體，免疫效價較低等缺點，這是因為Hc序列中AT含量豐富且存在大量的大腸桿菌稀有密碼子，這在一定程度上限制了它的表達。國內外許多研究者對破傷風Hc段的表達進行了改進，表達量得到了一定的提高，但仍達不到大量生產的需求，且制備得到的Hc免疫原性與傳統類毒素疫苗相比也較低。

為了解決這個問題，本研究擬采用序列及載體優化等手段，對國內破傷風強毒株CMCC64008株(GeneBank?No：AF154828)的Hc片段序列進行優化，通過在大腸桿菌中的可溶性高表達制備具有天然構象的亞單位疫苗，并對該疫苗的免疫劑量、免疫效價、保護效果等方面進行研究并進一步探索Tet-Hc作為亞單位疫苗可行性，為下一步深入制備破傷風Hc亞單位疫苗奠定基礎。

發明內容：

本發明的目的是提供一個經優化后可以在大腸桿菌中進行高效可溶性表達且能夠激發機體對破傷風毒素產生免疫保護作用的破傷風毒素受體結合區Hc基因及其編碼蛋白在破傷風亞單位疫苗中的應用。

本發明所提供的破傷風毒素受體結合區Hc基因，名稱為Tet-Hc，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ?ID?No.1的DNA序列；

2)編碼序列表中SEQ?ID?No.2的DNA序列；

3)與序列表中SEQ?ID?No.1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有激發機體對破傷風毒素產生免疫保護作用的核苷酸序列；

4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ?ID?No.1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

所述高嚴謹條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

序列表中的SEQ?ID?No.1由1353個堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-1353堿基，編碼具有序列表中SEQ?ID?No.2的氨基酸殘基序列的蛋白質。

所述破傷風毒素受體結合區Hc基因編碼的蛋白Tet-Hc，是下述氨基酸殘基序列之一：

1)序列表中的SEQ?ID?No.2；

2)將序列表中SEQ?ID?No.2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發機體對破傷風毒素產生生免疫保護作用的蛋白質。

序列表中的SEQ?ID?NO.2由451個氨基酸殘基組成。