[發明專利]用于檢測樣本中mircoRNAs含量的核苷酸序列及檢測方法

有效

• 申請號: 200910135756.6
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101538615A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 楊寶峰;王志國;呂延杰;張榮;初文峰
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N33/53
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及用于檢測樣本中microRNAs含量的核苷酸序列及檢測方法，尤其涉及一種采用金銀納米微球技術檢測樣本中microRNAs的方法。?

背景技術

心血管疾病已經成為人類健康和生命的頭號殺手。急性心肌梗死是急診科常見的急危重癥，但對于此病的治療效果卻不夠理想，其中一個重要原因是不能對心肌梗死的預后和并發癥的發生及時作出正確的判斷，以至于不能采取適當及時的治療方案和措施。惡性心律失常即是急性心肌梗死嚴重并發癥之一，是臨床治療的難點，也是該研究領域的熱點，后果嚴重，病死率高，如能早期發現，早期救治，能有效地挽救患者生命，對降低心肌梗死病死率具有重要意義。診斷急性心肌梗死主要靠心電圖檢查和心肌酶譜的檢測，但心電圖檢查的準確率只有50％，而且有30％的心臟病患者表現為心電圖正常，從而不能做出準確的診斷；而心肌酶譜的檢測也不夠理想，肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌鈣蛋白缺乏敏感性，胸痛后6-8小時濃度才逐漸上升，而肌紅蛋白的升高又缺乏特異性，所以目前的檢測手段尚不能對急性心肌梗死作出早期診斷，不易發現病情的進展，延誤治療時機。因此迫切需要一種新的高特異性和敏感性的生化指標來輔助診斷心肌梗死的發生，更重要的是作為一種預警指標來判斷急性心肌梗死的嚴重程度，對其預后和并發癥的發生及時作出有效的評斷和防治。?

microRNA在1993年即被發現，是長約19-25的核苷酸(RNA)分子，為非編碼小RNA。它可以通過與特定mRNA結合，抑制mRNA編碼蛋白質的翻譯過程來調控基因表達。目前人類基因組中已確認的microRNA有近八百個，可能參與30％人類蛋白質的表達調控。功能學研究表明microRNA參與調節包括細胞的增值、分化、凋亡、腫瘤發生等許多病理生理過程。近年來，microRNA在心律失常中的作用，取得了令人矚目的研究成果，一系列的研究證實microRNA參與調控多種心臟電活動相關蛋白的表達，是潛在的心律失常作用靶?點。其中研究較多的是肌肉特異表達的miR-1和miR-133。發明人發現miR-1是導致缺血性心律失常發生的關鍵因子，與各種心律失常關系密切。實驗證明miR-1在冠心病患者心肌組織中的表達水平是正常人心肌組織的2.8倍；在大鼠實驗性心肌缺血模型中觀察到同樣的結果：缺血12h后缺血區心肌miR-1表達量比正常對照組高2.6倍。應用在體轉染技術將miR-1特異性反義寡聚(脫氧)核苷酸(AMO-1)導入缺血心肌時，心律失常發生率明顯降低。另外，我們發現microRNA328可導致房顫的發生，miR-124-1與心衰和心肌纖維化有關聯，microRNA21可導致心肌肥厚。因此，我們設想心肌缺血引起某些miRNAs表達的改變，如microRNA1，microRNA133，microRNA328，miR-124-1，microRNA21是否會在血液中亦被檢測到，并與某些循環系統疾病的進展具有相關性。如果此假設成立，這些針對這些miRNA的檢測即可作為預警信號，通過對循環外周血的檢測，就可對疾病的預后判斷提供依據，為心肌梗死患者發生惡性心律失常等并發癥的早期發現提供依據，以便對心律失常作出早期診斷和處理，挽救患者生命，具有現實的臨床意義和良好的應用前景及經濟、社會效益。?

目前測定Northern?blot是國際上公認的miRNAs檢測的“金標準”方法，也發展了很多衍生方法，但是用這類方法檢測必須事先準備大量的總RNA樣本，且過程冗長，技術相對復雜，對檢測人員專業程度要求相對較高，所以可能限制其應用。何文蕾等人(生物化學與生物物理進展，2008，35(11)：1332～1338)利用納米金銀染增強技術建立了一種簡單快速的microRNA定量方法，以納米金標記的寡核苷酸分子作為信號探針，以生物素標記寡核苷酸分子作為捕獲探針，經鏈霉親和素-生物素作用將靶序列捕獲在固相載體酶標孔上，繼而通過納米金催化的銀染增強放大效應產生靈敏的識別信號，記錄其吸光度值從而實現microRNA分子的定量。其用于檢測小鼠肝臟、腦組織中miR-122a和miR-128各自的含量及合成miR-122a，在良好的線形范圍(10pmol/L～10fmol/L)內最低檢測限為10fmol/L。該方法簡單易行，無需放射性標記、熒光等昂貴設備。然而其靈敏度和特異度仍有待提高。?

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供用于測量樣本中microRNA的核苷酸序列以及一種新型的簡便、快捷、定量測量樣本中microRNA的方法。?