[發明專利]成熟miRNA定量檢測方法及試劑盒無效
| 申請號: | 200910135712.3 | 申請日: | 2009-04-27 |
| 公開(公告)號: | CN101871004A | 公開(公告)日: | 2010-10-27 |
| 發明(設計)人: | 陶建國;王保君;馮長訪 | 申請(專利權)人: | 馮長訪 |
| 主分類號: | C12Q1/68 | 分類號: | C12Q1/68;G01N21/64 |
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| 地址: | 450001 河南省鄭州*** | 國省代碼: | 河南;41 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 成熟 mirna 定量 檢測 方法 試劑盒 | ||
技術領域
本發明涉及生物領域中一種標本中成熟miRNA的定量檢測方法及試劑盒,可用于標本中成熟miRNA的表達量分析及臨床檢測。
背景技術
miRNA(microRNA)是一類非編碼、內源性的小RNA,長約21~25核苷酸(nucleotides,nt)。目前已經被發現并被miRBase數據庫收錄的人類miRNA有695種,絕大多數miRNA可以通過與靶基因的3-UTR區互補結合,抑制靶基因翻譯成蛋白質,進而在細胞及組織水平影響生物體的發育,并參與多種疾病的發生發展過程。一系列的研究表明miRNA在細胞成長、細胞分化及凋亡、同源異性盒基因調節、神經元極性、胰島素分泌、胚胎發育中的大腦形成及心臟發生、代謝等過程中都發揮著重要作用。成熟miRNA作為體液中客觀存在的標志物,其表達量的檢測也將有很重要的臨床意義。
自1993年首次發現miRNA以來,檢測其表達水平的技術方法也發展了許多種,目前已有的檢測方法主要有:(1)Northern雜交法:從1993年始,Northern雜交法就被應用于miRNA表達譜研究,也是首個用于半定量檢測miRNA的實驗技術,通過將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測樣品進行平行雜交,實現對miRNA的半定量檢測。而后,Northern雜交法成為檢測細胞中miRNA表達的常規研究方法之一。但Northern雜交法最大的缺點是對樣品的需求量較高,需要微克級樣品才能避免假陰性,有時樣品量需要達到40μg才會出現明顯雜交信號;(2)原位雜交法:原位雜交分為細胞和組織內原位雜交,該技術檢測miRNA表達,可更直觀的展示出miRNA的時空表達模式。該技術可以檢測同一細胞系中單個細胞中的miRNA表達,也可在不經分類和分離的情況下,比較不同細胞系中miRNA的表達水平,是分析miRNA表達的組織和時序特異性的有力工具。但其同樣存在跟Northern雜交的缺點,那就是對樣品的需求量高,很難在一般的檢測實驗中推廣;(3)基因芯片:最初的miRNA基因芯片,是將反義DNA探針點在尼龍膜上,然后以5′端放射性標記的miRNA樣品雜交,再經放射自顯影獲得信號。經過發展,基因芯片技術敏感度有了很大提高,且可用于多個miRNA同時檢測,但仍有很多不足之處:基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設備、結果是半定量的、重復性較差、不能同時優化所有待測miRNA的雜交環境、不能區分高度類似的miRNA等;(4)半定量RT-PCR:RT-PCR作為半定量檢測miRNA表達的常用實驗方法,在研究miRNA表達的過程中不斷得到改進。半定量RT-PCR是常用的一種簡潔、快速、特異的相對定量的RNA檢測技術,有研究用該技術成功對比了待測和對照樣本之間特異miRNA的表達差異,但只能測定miRNA的相對含量。該技術有以下優點:可在較短時間內獲得結果;高通量,可同時檢測多種miRNA的表達;與Northern雜交相比,僅需少量RNA,且不用放射性同位素標記;操作過程簡單。但該技術檢測miRNA表達時也有以下缺點:有的miRNA和其他miRNA具有同源區域,它們的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分,檢測的特異性不容易控制,不能很好的區分標本中的成熟miRNA和前體miRNA。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺點,提供一種可以特異性定量檢測標本中成熟miRNA的簡便、實用的方法及成套的試劑盒,可用于多種類型標本中成熟miRNA的表達量分析及臨床檢測。
本發明所涉及的miRNA檢測方法,其特征在于:提取總RNA(含miRNA),以發卡結構引物在逆轉錄酶的催化下合成cDNA,以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進行實時熒光PCR定量檢測成標本中成熟miRNA的含量。該檢測方法通過以下技術方案實現:(1)總RNA提取:A、樣品處理;B、RNA分離;C、RNA沉淀;D、RNA洗滌;E、RNA溶解;F、RNA濃度測定;G、RNA電泳檢測。(2)RNA的逆轉錄:以一個包含20-230nt長度的發卡序列和6-30nt特異性序列的引物進行逆轉錄反應,擴增相應的成熟miRNA的第一鏈cDNA。(3)熒光定量PCR檢測:以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進行實時熒光PCR定量檢測標本中成熟miRNA的含量。檢測的基本原理示意圖見附圖1,下面將通過一個具體實施方式詳細描述該技術方案。
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