[發明專利]成熟miRNA定量檢測方法及試劑盒

無效

• 申請號: 200910135712.3
• 申請日: 2009-04-27
• 公開（公告）號: CN101871004A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 陶建國;王保君;馮長訪
• 申請（專利權）人: 馮長訪
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物領域中一種標本中成熟miRNA的定量檢測方法及試劑盒，可用于標本中成熟miRNA的表達量分析及臨床檢測。

背景技術

miRNA(microRNA)是一類非編碼、內源性的小RNA，長約21～25核苷酸(nucleotides，nt)。目前已經被發現并被miRBase數據庫收錄的人類miRNA有695種，絕大多數miRNA可以通過與靶基因的3-UTR區互補結合，抑制靶基因翻譯成蛋白質，進而在細胞及組織水平影響生物體的發育，并參與多種疾病的發生發展過程。一系列的研究表明miRNA在細胞成長、細胞分化及凋亡、同源異性盒基因調節、神經元極性、胰島素分泌、胚胎發育中的大腦形成及心臟發生、代謝等過程中都發揮著重要作用。成熟miRNA作為體液中客觀存在的標志物，其表達量的檢測也將有很重要的臨床意義。

自1993年首次發現miRNA以來，檢測其表達水平的技術方法也發展了許多種，目前已有的檢測方法主要有：(1)Northern雜交法：從1993年始，Northern雜交法就被應用于miRNA表達譜研究，也是首個用于半定量檢測miRNA的實驗技術，通過將已知濃度梯度的寡核苷酸參照物與待測樣品進行平行雜交，實現對miRNA的半定量檢測。而后，Northern雜交法成為檢測細胞中miRNA表達的常規研究方法之一。但Northern雜交法最大的缺點是對樣品的需求量較高，需要微克級樣品才能避免假陰性，有時樣品量需要達到40μg才會出現明顯雜交信號；(2)原位雜交法：原位雜交分為細胞和組織內原位雜交，該技術檢測miRNA表達，可更直觀的展示出miRNA的時空表達模式。該技術可以檢測同一細胞系中單個細胞中的miRNA表達，也可在不經分類和分離的情況下，比較不同細胞系中miRNA的表達水平，是分析miRNA表達的組織和時序特異性的有力工具。但其同樣存在跟Northern雜交的缺點，那就是對樣品的需求量高，很難在一般的檢測實驗中推廣；(3)基因芯片：最初的miRNA基因芯片，是將反義DNA探針點在尼龍膜上，然后以5′端放射性標記的miRNA樣品雜交，再經放射自顯影獲得信號。經過發展，基因芯片技術敏感度有了很大提高，且可用于多個miRNA同時檢測，但仍有很多不足之處：基因芯片的制作和檢測需要昂貴的儀器設備、結果是半定量的、重復性較差、不能同時優化所有待測miRNA的雜交環境、不能區分高度類似的miRNA等；(4)半定量RT-PCR：RT-PCR作為半定量檢測miRNA表達的常用實驗方法，在研究miRNA表達的過程中不斷得到改進。半定量RT-PCR是常用的一種簡潔、快速、特異的相對定量的RNA檢測技術，有研究用該技術成功對比了待測和對照樣本之間特異miRNA的表達差異，但只能測定miRNA的相對含量。該技術有以下優點：可在較短時間內獲得結果；高通量，可同時檢測多種miRNA的表達；與Northern雜交相比，僅需少量RNA，且不用放射性同位素標記；操作過程簡單。但該技術檢測miRNA表達時也有以下缺點：有的miRNA和其他miRNA具有同源區域，它們的引物序列就是miRNA基因序列5′端的一部分，檢測的特異性不容易控制，不能很好的區分標本中的成熟miRNA和前體miRNA。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種可以特異性定量檢測標本中成熟miRNA的簡便、實用的方法及成套的試劑盒，可用于多種類型標本中成熟miRNA的表達量分析及臨床檢測。

本發明所涉及的miRNA檢測方法，其特征在于：提取總RNA(含miRNA)，以發卡結構引物在逆轉錄酶的催化下合成cDNA，以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進行實時熒光PCR定量檢測成標本中成熟miRNA的含量。該檢測方法通過以下技術方案實現：(1)總RNA提取：A、樣品處理；B、RNA分離；C、RNA沉淀；D、RNA洗滌；E、RNA溶解；F、RNA濃度測定；G、RNA電泳檢測。(2)RNA的逆轉錄：以一個包含20-230nt長度的發卡序列和6-30nt特異性序列的引物進行逆轉錄反應，擴增相應的成熟miRNA的第一鏈cDNA。(3)熒光定量PCR檢測：以miRNA特異性正向引物及通用反向引物進行實時熒光PCR定量檢測標本中成熟miRNA的含量。檢測的基本原理示意圖見附圖1，下面將通過一個具體實施方式詳細描述該技術方案。